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UNIVERSITY OF CALIFORNIA. IRVINE

 

 

___________________________________________________________________________________________________________ BERKELEY * DAVIS * IRVINE * LOS ANGELES * RIVERSIDE * SAN FRANCISCO * SANTA BARBARA * SANTA CRUZ

COLLEGE OF  MEDICINE

DEPARTMENT OF MEDICINE

DIVISIÓN OF INFECTIOUS DISEASES

 

LOS EFECTOS INMUNOMODULATORIOS DE HANSI IN VITRO E IN VIVO.

 

 

Darryl M. See 1, Jeremíah G. Tüles 1, Juan J. Hirschmann 2, Cesar E. Bertacchini 2,

Departamento de Medicina

Facultad de Medicina, Universidad de California, Irvine

Orange, California 92558

 

 

 

 

RESUMEN

 

Se han llevado a cabo investigaciones sobre los efectos inmunoestimulatorios in vitro e in vivo de HANSI.  Para esto, se aislaron las células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC) de los controles normales y, a pacientes con el Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) o con el Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida (SIDA) se les incubó durante 24 hs una dilución de 1:10 de HANSI o un 5% de placebo de etanol.  Es dable destacar que HANSI aumentó significativamente la actividad de la célula Natural Killer (NK) versus las células K562 en un ensayo estándar Cr 51 de 4h que se comparó a un placebo para las PBMC en controles normales (p<.05) o en pacientes con el SFC (p<.01) o SIDA (p<.01). Se suninistró un 5% de placebo de etanol o de HANSI a un grupo de ratas adolescentes CD-1 en una dosis de 0,35 cc en forma diaria durante 28 días.  Ninguna de los ratas manifestó evidencias de toxicidad macro o microscópica (ya sea en el cerebro, en el riñón, en el hígado, en el páncreas o en el corazón).  La función esplénica NK versus las células en diana YAC-1 fue mucho mayor en aquellas ratas que se habían tratado con HANSI (media 103 +/- 10,9 unidades líticas [LU]; p<.05) que las comparadas al placebo (media 81 +/- 7.4 LU).  A un grupo de ratas se las trató durante 21, 14, 7 y 0 días con HANSI o placebo y después se las expuso a unidades formadoras de plaquetas 1 x 10 4 (ufp) de una línea diabetogénica de virus coxsackie B4 (E2).                                                                                                        El tratamiento continuó durante 3 días más y luego se sacrificaron.  Los títulos de los virus en el páncreas se redujeron significativamente en el grupo HANSI que se había tratado durante 21 días antes de la exposición viral (media [log 10] 3,14 +/- 0,79 ufp/mg; p<.05) en comparación con el placebo (4.29 +/- 0,90 ufp/mg).  HANSI no evidenció ningún efecto antiviral in vitro.  Por lo tanto, HANSI aumentó la función NK in vitro e in vivo y no produjo ningún efecto tóxico en los ratas.  Se demostró una actividad antiviral a través, presuntamente del efecto intensificador de la inmunidad.

 

 

INTRODUCCIÓN

 

El Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) es una alteración de etiología desconocida que se caracteriza por síntomas que perduran en forma permanente, una fatiga aguda y los defectos cognoscitivos (1).  En la actualidad el diagnóstico se basa en los criterios clínicos establecidos por el Centro para el Control y la Prevención de las Enfermedades.  Varias hipótesis se han propuesto para explicar la causa de la enfermedad como por ejemplo la disfunción psiquiátrica (2), los disturbios de las glándulas del hipotálamo, las pituitarias y suprarenales (3), las irregularidades inmunológicas (4) y/o las infecciones vírales (5).  Todavía no se ha podido encontrar un tratamiento eficaz para esta enfermedad.

El Síndrome de Inmunodeficíencia Adquirida (SIDA) es la última etapa de una enfermedad causada por una infección crónica del Virus de Inmunodeficiencia Humano (HIV).  La mayoría de los pacientes afectados desarrollan a lo largo de los años una deficiencia progresiva del sistema inmune que finalmente termina en muertes causadas por uno o mas cánceres o por infecciones oportunistas.

Se ha observado en pacientes con el Síndrome de Fatiga Crónica (SFC) a veces que la función de la célula Natural Killer (NK) ha disminuido y algunos estudios han demostrado un efecto clínico beneficioso de los moduladores inmunes (6,7).  Los individuos infectados con HIV padecen una función NK defectuosa que, en forma progresiva, se degenera a medida que la enfermedad avanza (8).  Todavía no se ha observado en estos pacientes un efecto clínico positivo e intensfflcador de la inmunidad, aunque la terapia con Interleuquina 2 (IL-2) resultó ser beneficiosa en una investigación que se ha llevado a cabo (9).  Por lo tanto, el SFC y el IUV son similares en el sentido en que ambos se caracterizan por dar como resultado la disminución de la función NK. Para el caso del HIV, el rol de los virus está probado y para el caso del SFC es un supuesto, y no hay cura.  Por lo tanto, no es sorprendente que muchos pacientes recurran a otras modalidades de tratamientos como por ejemplo las preparaciones homeopáticas que se encuentran a un lado de la corriente principal de la medicina Occidental.

Los preparados homeopáticos se han usado para tratar una amplia gama de enfermedades desde fines del siglo XVIII (10).  Estos medicamentos homeopáticos se realizan en base a preparados vegetales, animales o minerales y se diluyen con líquidos hasta concentraciones micromolares.  La eficacia de las fórmulas homeopáticas nunca se ha comprobado en forma científica, aunque hay dos meta-análisis que dieron resultados positivos en mas del 65% de las pruebas clínicas (11, 12).  Sin embargo, hay que tener en cuenta dos factores: Por un lado, probablemente, a la mayoría de estas pruebas no se las controló correctamente y, por el otro lado, no se debe haber incluido la cantidad necesaria de pacientes.  Hasta el día de hoy, se desconoce cuál es el mecanismo de acción de los productos homeopáticos.

HANSI y otras preparaciones homeopáticas postulan como resultado mas válido al efecto intensificador de la inmunidad.  HANSI contiene 5% de alcohol y concentraciones micromolares de Cactus Grandiflora, Aloe Socotrina, Abies Nigra, Arnica, Lachesis, Carbonato de Calcio y Licopodium. Los informes históricos sugieren como resultado una mejor sobrevivencia y una calidad de vida superior en algunos pacientes infectados con HIV.  La preparación ha resultado ser no tóxica en el uso adjutor y medido para pacientes con cánceres incurables.  En este estudio, se realizaron las siguientes observaciones:

 

* HANSI estimuló en forma significativa la actividad in vitro de la Célula Natural Killer, de las células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC) de los controles normales y de los pacientes con SFC o SIDA.

* Cuando se la administró en altas dosis a las ratas resultó ser no tóxica.

* La preparación aumentó en forma significativa la función esplénica NK en ratas.

* HANSI redujo la infección en el páncreas de las ratas que habían sido expuestas a una línea diabetogénica de virus CVB4 (E2).

 

 

 

 

MATERIALES Y METODOS

 

 

Preparación médica:

 

Se combinaron extractos de Cactus Grandiflora, Aloe Socotrina, Abíes Nigra, Árnica, Lachesis y Licopodium con Carbonato de Calcio de acuerdo con los métodos y las especificaciones de la Farmacopea Homeopática de Estados Unidos .  A cada extracto se lo diluyó en 5% de etanol y agua esterilizada y se lo combinó con los demás componentes y a la mezcla final se la potenció por medio de centrifugado.  El análisis de la mezcla final por medio de una espectrofotometría reveló que el contenido solo está formado por agua y etanol.  Este resultado se condice con la práctica homeopática estándar que consiste en diluir los componentes iniciales a tal punto que posteriormente no pueden detectarse a través de los métodos comunes.

 

 

Los estudios in-vitro

 

El efecto de HANSI sobre la función NK:

 

La preparación de las PBMC:

 

Se extrajo sangre anticoagulada de 20 individuos normales elegidos del personal del Centro Médico de Irvine, de la Universidad de California entre las 12:00 hs y las 14:00 hs y de otros 20 pacientes agrupados de acuerdo a la edad y al sexo que padecían el SFC (como lo definió la CDC en 1988) o SIDA (CD4 cantidad <200).  A los pacientes con SFC o SIDA se les permitió tomar medicamentos (con o sin receta) pero no se les permitió el uso de agentes con efectos inmunomodulatorios ya sean demostrados o supuestos como lo son los corticoides, los factores que estimulan colonias, la interleuquina-2, los interferones o la quimioterapia para el cáncer.  A las PBMC se las separó de las otras células por medio de la centrifugación estándar por gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (13).  A las células PBMC se las mantuvo en completo RPMI con suero bovino fetal (SBF) al 10% inactivado por calor.  Inmediatamente después se las testeó.

 

Ensayo de la función Natural Killer:

 

La actividad celular NK fue determinada por una variación de un ensayo estándar de citotoxicidad.

Las células K562, mantenidas en completo RPMI con 10% de SBF (inactivado por calor) fueron marcadas como células target.  Fueron clasificadas con 20 uC 51 Cr (ICN, Costa Mesa, CA) durante una hora a 37°C (5% CO2), se lavaron 4 veces con medio y se agregó a una concentración de 5 x l03 células/well en 96-well estructuras de microtítulo U-bottom.  Las células electoras (PBMC) se agregaron por triplicado a las wells en un radio target efector de 40:1, 20:1, 10:1 y 5:1 con HANSI en una dilución total de 1: 10 o con etanol para darle una concentración final de 0,5%.  En alguno de los casos las células efectoras habían sido pre-incubadas con un aditivo de 24 hs. Las control wells contenían células target y solamente, ya sea HANSI o etanol para la determinación de la lisis espontánea, o el 3% de Triton X-100 para poder evaluar la lisis total.  Después de una incubación de 4 horas a 37°C (5% C02), las células fueron centrifugadas durante 10 minutos a 1.500 x g, y se extrajo flotante 100 ul del supenatante y se mezcló con 2,5 ml del cocktail del centelleo (Fisher Scientfflc, Tustin,CA).  La radioactividad se determinó por el contador de centelleo líquido (Beckman LS-100) y la actividad citotóxica se calculó en base a las unidades líticas (LU) por medio de un programa de software que H. Pross nos proporcionó (15).  A una unidad lítica se la define como el número de células efectoras requeridas para lograr una lisis específica del 20% de 5 x 103 targets.  Las LU fueron calculadas cada 107 células efectoras.

 

La actividad y la toxicidad antiviral in vitro:

 

La actividad del virus se determinó en las células monocapas Monkey Kidney (MK) en presencia del 5% de etanol o diluyente L15 de Liebovitz's (controles) o diluciones de HANSI en sucesivas concentraciones aumentadas 10 veces con el virus cocksackie B4 (CVB4) cepa E2 a un inóculo de 1 unidad formadora de placas (PFU) por célula.  La toxicidad de la célula se determinó marcando la formación morfológica y monoestrática de las células MK que crecieron en presencia del HANSI sin diluir (la concentración final del 20%).

 

 

La prueba in vivo:

 

Animales: Se usaron ratas adolescentes CD-1 de 4 semanas de vida de la Granja de Charles River (Wilmigton, MA).

 

Virus: CVB4 cepa E2 se propagó y se mantuvo de acuerdo a la explicación descripta (16).

 

Métodos experimentales:

 

Estudio de la toxicidad:

 

Se administró placebo (etanol 5%) o HANSI a grupos de 10 ratas adolescentes CD-1.  Se les inyectó diariamente en forma subcutánea 0,35 cc de placebo o la preparación activa durante 28 días consecutivos.  Se las observó diariamente para ver si se habían producido evidencias de alta toxicidad (ataxia, letargo o irregularidad respiratoria).  Después de 28 días, las secciones de los cerebros, riñones, hígados, páncreas y corazones se introdujeron en formalina, se embebieron en parafina, se cortaron con un micrótomo y se fijaron sobre la platina con hematoxilina y eosina para examinarlos con el microscopio y, así observar los cambios histopatológicos.

 

El efecto in vivo de HANSI sobre la estimulación de la función esplénica NK:

 

A las ratas CD-1 se les suministró diariamente durante 28 días consecutivos en forma subcutánea 0,35 cc de HANSI o 5% de etanol (placebo). Se extrajeron los bazos y se los presionó a través de una malla metálica de acero inoxidable y se los mantuvo en completo RPMI.  Se agregó 0,83% de cloridio amonium durante 3 minutos para disolver los eritrocitos.  Las células mononucleares se separaron de las demás poblaciones de células por medío de la centrifugación Ficoll-Hypaque, mantenidas en completo RPMI y se las usó inmediatamente después como células efectoras.  Las células YAC-1 sensibles a las NK (Colección del Tipo de Cultura Norteamericana) se mantuvieron en RPMI completo y se las usó como células target.  Se las identificó como 50 uC 51 Cr durante una hora y media a 37° (5% CO2), se las lavó 4 veces con medio, y se agregaron a una concentración de 1 x 104 células/well.  Las células efectoras esplénicas se agregaron por triplicado a las well en un radio target efector de 40:1, 20:1, 10:1 y 5:1.  La radioactividad en 100 ul de supenatente se midió como se describió anteriormente y se calculó en LU.

 

El efecto antiviral in vivo:

 

Se les administró a las ratas 0,35 cc de placebo (etanol 5%) o HANSI en forma subcutánea diariamente durante 21,14 ó 7 días consecutivos antes de la exposición con el virus, o comenzando el día de la incubación del virus.  A los animales se los expuso en forma intraperitoneal con unidades formadoras de placas (ufp) 1 x 104 CVB4 cepa E2. El tratamiento continuó de la misma forma.  Tres días después de la inoculación del virus se obtuvieron muestras de los páncreas.  El título del virus en el tejido homogeneizado se determinó por medio de un ensayo de placas.  Las ratas de control solo recibieron a HANSI pero sin exposición viral para poder evaluar la toxicidad.  Las restantes solo recibieron el 5% de etanol y sirvieron como controles sin infección.

 

 

RESULTADOS

 

Ensayo de NK in vitro:

 

La función promedio NK fue de 103,7 +/- 22,1 LU en 20 controles normales.  La función NK se redujo considerablemente en 20 pacientes con el SFC (47,3 +/- 16,2:P<.01) y en 20 pacientes con SIDA (8,0 +/- 3,8; P<.001). Un aumento significativo de la función NK para los tres grupos se observó cuando las PBMC preincubadas durante 24 horas con HANSI se usaron como efectores comparados con los efectores sin ningún aditivo (Cuadro l).  El efecto fue mayor para los pacientes con SFC o SIDA (P<.01 para los dos casos).  El agregado de etanol o HANSI sin la preincubación no aumentó la función NK en ninguno de los grupos.

 

El efecto y la toxicidad antiviral in vitro:

 

La respuesta del CVB4 cepa E2 no se inhibió ante las concentraciones de HANSI.  No se observó ningún tipo de toxicidad en la célula MK (redondeo de la célula y/o irregularidad monoestrática) después de la incubación con HANSI sin diluir.

 

La toxicidad in vivo:

 

No hubo signos de toxicidad densa ni microscópica en ninguno de los tejidos examinados.

Estimulación in vivo de la función esplénica NK:

 

La función esplénica NK versus las target YAC-1 fue significativamente mayor en las ratas tratadas con HANSI durante 28 días (promedio 103 +/- 10,9 LU; P<.05) que las comparadas con el placebo (promedio 81 +/- 7,4 LU).

 

El efecto antiviral in vivo:

 

Los títulos del virus en el páncreas se redujeron significativamente en el grupo HANSI que se trató durante 21 días antes de la exposición al virus (promedio <log 10> 3,14 +/- 0,79 ufp/mg; P<.05) en comparación con los animales infectados tratados con un placebo similar (4,29 +/- 0,90 ufp/mg; Cuadro l).  El tratamiento con HANSI durante 14 días o inferior a los 14 días antes de la exposición del virus no provocó una reducción en el título del virus en el páncreas cuando se lo comparó con las ratas que se habían tratado con un placebo similar.

 

ANÁLISIS

 

Los resultados de varios informes históricos y los estudios que se han llevado a cabo sin el suficiente control sugieren que los productos homeopáticos pueden ser beneficiosos en situaciones clínicas como la diarrea, rinitis alérgica e influenza (17,18,19).  La mejor prueba de eficacia ha sido la que se ha efectuado para el asma dado que las tres pruebas controladas por placebo en las que se usaron preparaciones homeopáticas con alergenos dieron buenos resultados (20,11,18).

Los productos homeopáticos contienen sustancias que se han diluido a tal punto que ni siquiera se las puede detectar a través de la espectrometría.  Tampoco se ha podido descubrir cuáles son los mecanismos de acción de estos productos.  Sin embargo, este hecho no debería desalentar a las investigaciones que se inicien en el futuro sobre la homeopatía y sobre otras terapias como por ejemplo la inmunoterapia de la alergia que actúa a través de procesos que hasta hoy son completamente desconocidos.  Las investigaciones sobre homeopatía debería llevarse a cabo empleando métodos aleatorios controlados por placebos y teniendo en cuenta los objetivos finales.  De esta forma se debería arribar a estudios positivos.

Los resultados sobre HANSI, que consiste en una preparación homeopática en base a una mezcla de productos vegetales, animales y minerales, sugieren que aumenta la función NK in vitro y en ratas.  Los resultados positivos obtenidos en el estudio in vitro son realmente notables dado que, con anterioridad, no se había establecido ninguna evidencia de actividad in vitro de ningún producto homeopático.  Las investigaciones in vitro deberían ayudar a estudiar productos promisorios antes de efectuar las pruebas clínicas pertinentes.  Los resultados también sugieren que es probable que se requieran realizar modificaciones en los ensayos in vitro que estén bien establecidos, posiblemente debido a que los mecanismos de acción de los productos homeopáticos son diferentes a los de los medicamentos alopáticos.  Por ejemplo, en este estudio, un ensayo estándar sobre la función NK que libera Cr 51 de 4 h no ha demostrado que HANSI sea eficaz.  En efecto, se necesitó llevar a cabo la preincubación con células efectoras.  Hasta el presente se desconoce la razón de este descubrimiento y, por esto, es necesario que se siga investigando sobre el tema.

HANSI demostró ser eficaz porque logró estimular la función NK in vitro en pacientes afectados por el SFC y SIDA que son alteraciones que se originan debido a que la inmunídad celular es defectuosa.  Por lo tanto, es realmente necesario realizar pruebas para poder establecer la eficacia clínica en las enfermedades inmunológicas.  La elaboración del mecanismo de la estimulación NK también está garantizada  Finalmente, esta investigación demostró que la estimulación NK pudo lograrse in vivo (usando ratas) y que el aumento de inmunidad dio como resultado establecer una barrera de protección al virus NK, CVB4. Sín embargo, el uso potencial como agente antiviral se dificulta por el hecho de que se requiere un período de tratamiento anterior (21 días).  Por lo tanto, HANSI podría llegar a ser mas útil como agente profiláctico que como tratamiento para contrarrestar las acciones de una infección viral aguda.  Las excepciones serían persistentes: los virus sensibles a la célula NK como lo son la hepatitis B y el HIV.

 

Cuadro 1:

Efecto de HANSI sobre la función NK para las PBMC de los controles normales ó pacientes con SFC ó SIDA.

 

 

 

DIA DE INICIO

HANSI

PLACEBO

P

0

4,36 +/- 1,01

4,17 +/- 0,96

NS

-7

4,11 +/- 0,85

4,33 +/- 0,35

NS

-14

3,95 +/- 0,99

4,21 +/- 0,79

NS

-21

3,14 +/- 0,79*

4,29 +/- 0,90

< 0.5

 

                                                              

Los resultados representan promedios para grupo de 10 ratas.

A los animales se los trató con 0,35 cc de placebo o con HANSI.  Se les inyectó en forma subcutánea desde el comienzo hasta el día en que se las sacrificó.

* A los títulos <2 se les asignó un valor de 1 para poder determinar el promedio.

NS = No es signficativo.  

 

 

REFERENCIAS

 

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