การสร้างสมการเอนไซม์และทำความเข้าใจ
ในกรณีที่สารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์คือสารตั้งต้นความเข้มข้นสูง
(1 ก.พ. 47)

เนื่องจากที่คุณ Pracitcal x 2 ได้เอาเรื่อง enzyme มาให้ได้อ่านกันอีกครั้ง ก็เลยทำให้ผมมีข้อสงสัยที่อยากจะรบกวนให้ช่วยอธิบายเพิ่มเติมอีก

คือเรื่องการหาค่า Km Vmax และ Ki สำหรับปฏิกิริยาที่มี inhibitor สำหรับ competitive inhibition นั้นผมพอจะมองออกจากการได้ดู model ที่คุณ Practical x 2 ได้เขียนไว้ แต่สำหรับ noncompetitive inhibition ล่ะครับ เราจะมีวิธีหา Km Ki และ Vmax อย่างไร

ที่ผมลองคิดดู ณ เวลานี้ จะได้

v = Vmax/1 + I/Ki + Km/S----(1)

หรือถ้ามอง ว่า S เองมีคุณสมบัติเป็น inhibitor ด้วย ก็จะได้ว่า

V = Vmax/1+S/Ki + Km/S
หรือ
V = VmaxS/S(1+s/Ki) + Km -----(2)

ซึ่งผมมองไม่ออกว่าจะทดลองหา Ki Km และ Vmax ได้อย่างไร นอกจากต้องดัดแปลงสมการว่ามันจะมีพฤติกรรมใกล้เคียง Michaelis-Menten Eq. เมื่อ S น้อยๆ ซึงจะทำให้ (1+s/Ki) ใกล้เคียง 1 ทำให้สมการมีหน้าตาเหมือน M-M Eq.

ดังนั้น ผมจึงสามารถนำข้อมูลในช่วง S น้อยมาหาค่า Vmax และ Km ก่อน แล้วจากนนั้น นำ 2 ค่านี้มาแทนค่า หา Ki ในช่วงข้อมูลที่ใช้ S สูงๆ

ไม่ทราบว่าแนวคิดแบบนี้ถูกต้องหรือไม่ รบกวนช่วยชี้แนะด้วยนะครับ

ขอบคุณมากครับ

สำหรับเรื่อง Noncompetitve Inhibition นั้นเราสามารถจัดรูปสมการให้เป็น 1/v = {(Km/V)(1 + [I]/Ki)}(1/[S]) + (1/V)(1 + [I]/Ki) ได้ครับ และเมื่อเราพล็อตกราฟ โดยให้ 1/v เป็นแกน Y และ 1/[S] เป็นแกน X เราก็จะหาค่าของ (Km/V)(1 + [I]/Ki) (ความชัน) และ (1/V)(1 + [I]/Ki) (จุดตัดแกน Y) ได้ครับ โดยค่า Km และ V เราหา ออกมาได้จากสมการของ Michaelis-Menten ที่ไม่มีสารยับยั้งเอนไซม์ อยู่ครับ

ขอบคุณครับ สำหรับคำตอบ

แต่สำหรับจุดที่ผมยังสงสัยอยู่คือ เมื่อ S และ I คือตัวเดียวกัน ดังที่แสดงใน (2)

V = VmaxS/S(1+s/Ki) + Km -----(2)

ที่ลองจัดรูปออกมาโดยหวังว่าจะเลียนแบบ Lineweaver burk plot กลับได้สมการที่ S สามารถมีได้ 2 ค่า
คือหมายความว่าหลังจากจัดรูปสมาการใหม่ จะได้ สมการของ S อยู่ในรูปกำลัง 2 ซึ่งทำให้ S มีได้ 2 ค่าโดยยังให้ V เท่าเดิม

และได้ความสัมพันธ์ ของ V = Vmax เมื่อ S= รากที่2ของ KsKi

เมื่อเป็นเช่นนี้แล้ว ผมจึงล้มเหลวกับการพยายามจะจัดสมการที่ (2) เพื่อจะ plot หาค่าต่างๆตามวิธี lineweaver burk

เท่าที่มีความรู้พอจะคิดได้ตอนนี้ ก็คืออย่างที่ได้เสนอไปในความเห็นที่3 ในตอนท้ายนั่นหละครับ

อ่อ พอดีเจอ web นี้เข้า

การหา kinetic constants ของเขาน่าจะคล้ายๆอย่างที่ผมคิด

ยังติดใจกับสมการที่ S มีได้ 2 ค่า แต่ยังให้ V เท่าเดิม แสดงว่า การเปลี่ยนแปลงของ V ที่เป็น function ของ S ก็น่าจะมีได้ 2 ทางงั้นหรือครับ ช่วยแนะนำด้วยนะครับ ขอบคุณครับ

โดยทั่วไประบบของเอนไซม์ที่มีสารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ (inhibitor) เป็นสารตั้งต้นที่มีความเข้มข้นสูงนั้น เป็นระบบที่ย้อนกลับได้ (reversible) กล่าวคือถ้าลดความเข้มข้นของสารตั้งต้นลง เอนไซม์ก็จะทำงานได้ตามปกติ นอกเหนือจากสารตั้งต้นแล้วก็ยังมีสารเคมีตัวอื่น ๆ ที่ยับยั้งการทำงานของเอนไซม์ได้โดยมีกระบวนการยับยั้งแบบต่าง ๆ กัน เช่น competitive, non-competitive, และ uncompetitive ในตอนนี้ผมจะยังไม่กล่าวถึงกรณีเหล่านี้ครับ

เพื่อให้เข้าใจเรื่องของ inhibition mechanism มากขึ้น ผมขอพูดถึงเรื่องของ King & Altman Procedure ก่อนครับ

สมการเอนไซม์นั้นเกิดขึ้นมาได้จากการใช้สมมติฐานหลายประการ ดังที่ผมได้แสดงวิธีหาไว้ในเรื่องของ สมการเอนไซม์ Michaelis-Menten kinetics อย่างไรก็ดีวิธีดังกล่าวใช้ได้แต่กรณีที่ง่าย ๆ เท่านั้น เมื่อเรามีเอนไซม์คอมเพล็กซ์ต่างชนิดมากขึ้น การหาสมการความสัมพันธ์ระหว่างความเข้มข้นของเอนไซม์คอมเพล็กซ์ชนิดต่าง ๆ กับความเข้มข้นของเอนไซม์รวมตอนตั้งต้น (Eo) จะยากขึ้นเท่านั้น ด้วยเหตุนี้ในปี ค.ศ. 1956, King & Altman ได้คิดค้นวิธีหาสมการความสัมพันธ์แบบที่ง่ายกว่าเดิม โดยเริ่มการพิสูจน์ด้วยเมตริกซ์ ใช้ Cramer’s rule และท้ายที่สุดสรุปเป็นขั้นตอนที่ใช้การวาดลูกศรคำนวณหาสมการออกมา ซึ่งนับว่าเป็นอีกก้าวสำคัญในการพัฒนาเรื่องของเอนไซม์ หลังจากการค้นพบนี้นักวิทยาศาสตร์ท่านอื่น ได้พยายามปรับปรุงวิธีการคำนวณแตกแขนงออกมาจากวิธีดั้งเดิมมากมาย และในหลายกรณีก็ได้คิดโปรแกรมคอมพิวเตอร์ขึ้นมาคำนวณหาสมการเหล่านั้น ก่อนหน้ายุคไมโครคอมพิวเตอร์ ก็มีการออกแบบโปรแกรมสำหรับคอมพิวเตอร์ที่ใช้ระบบ punchcard (Fortran) ขึ้น สำหรับผมเองก็ได้ประยุกต์หลักการของ King & Altman มาออกแบบโปรแกรมคอมพิวเตอร์ใน VBA6.0 สำหรับ EXCEL2000 ซึ่งผมใช้วิเคราะห์สมการเอนไซม์ในงานวิจัยที่มีจำนวนเอนไซม์คอมเพล็กซ์ 8 ชนิด ในสมการเคมีร่วม 20 สมการ (ดูภาพประกอบ 1) กระทั่งได้สมการดิฟเฟอเรนเชี่ยล (ดูภาพประกอบ 2) อันเป็นประโยชน์ในการ modelling เอนไซม์ตัวที่ผมศึกษาอยู่ และเป็นบทหนึ่งในวิทยานิพนธ์ปริญญาเอก ขณะนี้ผลงานวิจัยดังกล่าวถูกส่งไปพิจารณาเพื่อตีพิมพ์ในวารสาร Journal of Biotechnology ครับ (ดูภาพประกอบ 3 - 5 สำหรับตัวโปรแกรม)

ภาพประกอบ 1 : แสดงแผนผังปฏิกิริยาเคมีสำหรับเอนไซม์ที่มีเอนไซม์คอมเพล็กซ์ 8 ชนิด

ภาพประกอบ 2: แสดงสมการดิฟเฟอเรนเชี่ยลที่ได้หลังจากการวิเคราะห์จากภาพประกอบ 1 และปรับให้เหมาะสมด้วยข้อมูลจากการทดลอง

ภาพประกอบ 3 : ผลลัพธ์จากโปรแกรมคอมพิวเตอร์ของ Practical x 2

ภาพประกอบ 4 : ผลลัพธ์จากโปรแกรมคอมพิวเตอร์ของ Practical x 2

ภาพประกอบ 5 : ส่วนหนึ่งของ source code จากโปรแกรมคอมพิวเตอร์ของ Practical x 2

ขั้นตอนการหาสมการเอนไซม์ด้วยวิธีของ King & Altman นั้นเราเรียกสั้น ๆ ว่า King & Altman (KAN) procedure ครับ ผมจะยกตัวอย่างเพื่อให้เข้าใจวิธีนี้กันมากขึ้นครับ โดยใช้สมการของ Michaelis-Menten เป็นตัวอย่าง ซึ่งเราทราบอยู่แล้วว่า
E + S <----> ES ----> E + P
ซึ่งเราอาจแยกสมการย่อยได้เป็น
E + S –(k1)--> ES……..(1)
ES ---(k-1)--> E + S…...(2)
ES ----(k2)---> E + P…..(3)

ขั้นที่ 1 ของ KAN คือนับจำนวนเอนไซม์คอมเพล็กซ์ ในกรณีนี้มี 2 ตัวคือ E และ ES

ขั้นที่ 2 ของ KAN คือให้ลากลูกศรแสดงทิศทางของสมการเคมีระหว่างเอนไซม์คอมเพล็กซ์ต่างชนิดกัน โดยมีข้อแม้ว่า
2.1) โดยภาพรวมลูกศรในแบบแผน (pattern) หนึ่ง ๆ จะต้องเชื่อมต่อกับเอนไซม์คอมเพล็กซ์ทุกตัวในระบบ โดยทิศทางของลูกศรจะต้องพุ่งเข้าสู่เอนไซม์คอมเพล็กซ์ชนิดที่กำลังพิจารณาอยู่
2.2) จำนวนของลูกศรในแบบแผนหนึ่ง ๆ จะมีได้เพียง = จำนวนเอนไซม์คอมเพล็กซ์ – 1 ซึ่งในกรณีนี้คือ 2 – 1 = 1
2.3) แบบแผนนั้น ๆ จะต้องไม่ทำให้เกิดวงล้อมแบบปิด เช่น (ตัวอย่างจากกรณีอื่น) E--->ES---->EQ----->E แบบนี้ไม่ได้

ขั้นที่ 3 ของ KAN ดูตัวอย่างต่อไปนี้

เอนไซม์ E; แบบแผนที่ 1 = ES---(k-1)---> E; แบบแผนที่สอง = ES—(k2)---> E ดังนั้นรวมแบบแผนสำหรับเอนไซม์ E คือ k(-1) + k2 ซึ่งผลรวมนี้ใช้เขียนเป็นสมการได้ว่า [E]/[Eo] = (k(-1) + k2)/ T สมการสำหรับ T นั้นเราจะทราบได้หลังการวิเคราะห์นี้แล้ว

เอนไซม์ ES; แบบแผนที่ 1 = E---(k1[S])--->ES ดังนั้นรวมแบบแผนสำหรับ ES คือ k1[S] ซึ่งผลรวมนี้ใช้เขียนเป็นสมการได้ว่า [ES]/[Eo] = k1[S]/ T ถึงตรงนี้ขอให้สังเกตการปรากฎของ [S] พร้อมกับ rate constant k1 ด้วยครับ

ค่า T ของเอนไซม์คอมเพล็กซ์และเอนไซม์ E คือ k(-1) + k2 + k1[S]

ดังนั้น [E]/[Eo] = (k(-1) + k2)/(k(-1) + k2 + k1[S])
และ [ES]/[Eo] = k1[S]/(k(-1) + k2 + k1[S]) หรือ [S]/({k(-1) + k2}/k1 + [S]) หรือ [S]/(Km + [S])

อัตราการสร้างสารผลิตภัณฑ์ (v) คือ v = k2[ES] = k2[Eo][S]/(Km + [S]) = V[S]/(Km + [S])
โดยที่ V หรือ Vmax = k2[Eo] และ Km = (k(-1) + k2)/k1 และนี่ก็คือ Michaelis-Menten (MM) Equation ครับ
จะเห็นได้ว่าไม่มีการใช้สมการดิฟเฟอเรนเชี่ยลขึ้นมาให้เห็นเลย ^ ^

สำหรับกรณีที่สลับซับซ้อนขึ้น สามารถศึกษาเพิ่มเติมได้จากเอกสารอ้างอิงเหล่านี้ครับ
Cornish-Bowden A. 1995. Fundamentals of enzyme kinetics. Portland Press, London, Chapter 4.
Palmer T. 1991. Understanding enzymes, 3rd edition. Ellis Horwood, New York, pp. 135-137.

หลักจากที่เรียนรู้วิธีสร้างสมการเอนไซม์แบบนี้ไปแล้ว เราย้อนกลับมาดูปัญหาสมการเอนไซม์ที่มีสารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์เป็นสารตั้งต้นที่มีความเข้มข้นสูงกันครับ

ในกรณีสมการเอนไซม์ของคุณ TimeS นั้น เป็นกรณีที่สารตั้งต้นเกิดคอมเพล็กซ์กับเอนไซม์คอมเพล็กซ์ ES (binary) อีกทีหนึ่งทำให้เกิดเอนไซม์คอมเพล็กซ์ ESS (ternary) ซึ่งเป็นรูปที่ไม่ทำให้เกิดสารผลิตภัณฑ์ขึ้น ซึ่งเราวาดผังสมการรวมได้ตามภาพข้างล่างครับ (ถ้าผังสมการไม่เหมือนกับข้างล่าง สมการดิฟเฟอเรนเชี่ยลอาจจะไม่เหมือนกัน)

อ้างอิงผังสมการดังกล่าวจาก
Stephanopoulos GN, Aristidou AA, Nielsen J. 1998. Metabolic Engineering: Principles and Methodologies. Academic Press, New York, pp.157-159.

เรามาใช้ KAN procedure ในการสร้างสมการเอนไซม์นี้กันครับ
ระบบเอนไซม์นี้มีคอมเพล็กซ์และเอนไซม์อิสระทั้งหมด 3 ชนิดคือ E, ES, ESS ดังนั้นในแต่ละแบบแผนจะมีได้ 3 – 1 = 2 ลูกศรแสดงทิศทางของปฏิกิริยา

เอนไซม์ E; แบบแผนที่ 1 = ESS---(k-2)--->ES---(k-1)---> E; แบบแผนที่สอง = ESS---(k-2)--->ES—(k3)---> E
ดังนั้นรวมแบบแผนสำหรับเอนไซม์ E คือ k(-2)k(-1) + k(-2)k3 ซึ่งผลรวมนี้ใช้เขียนเป็นสมการได้ว่า
[E]/[Eo] = (k(-2)k(-1) + k(-2)k3)/ T

เอนไซม์ ES; แบบแผนที่ 1 = E---(k1[S])--->ES<----(k-2)----ESS ดังนั้นรวมแบบแผนสำหรับ ES คือ
k(-2)k1[S] ซึ่งผลรวมนี้ใช้เขียนเป็นสมการได้ว่า [ES]/[Eo] = k(-2)k1[S]/ T

เอนไซม์ ESS; แบบแผนที่ 1 = E---(k1[S])--->ES---(k2[S])--->ESS ดังนั้นรวมแบบแผนสำหรับ ESS คือ
k1k2[S][S] ซึ่งผลรวมนี้ใช้เขียนเป็นสมการได้ว่า [ESS]/[Eo] = k1k2[S][S]/ T

ค่า T ของเอนไซม์คอมเพล็กซ์และเอนไซม์ E คือ k(-2)k(-1) + k(-2)k3 + k(-2)k1[S] + k1k2[S][S]

เราสามารถตรวจสอบผลการวิเคราะห์นี้ได้จากโปรแกรมที่ผมแนะนำข้างต้นครับ

ซึ่งพบว่าได้ผลลัพธ์ตรงกัน

ดังนั้น [E]/[Eo] = (k(-2)k(-1) + k(-2)k3)/(k(-2)k(-1) + k(-2)k3 + k(-2)k1[S] + k1k2[S][S]),
[ES]/[Eo] = k(-2)k1[S]/ (k(-2)k(-1) + k(-2)k3 + k(-2)k1[S] + k1k2[S][S]),
และ [ESS]/[Eo] = k1k2[S][S]/ (k(-2)k(-1) + k(-2)k3 + k(-2)k1[S] + k1k2[S][S])

เราเขียนสมการดิฟเฟอเรนเชี่ยลแสดงอัตราการเกิดสารผลิตภัณฑ์ในกรณีที่สารยับยั้งการทำงานของเอนไซม์เป็นสารตั้งต้นได้ดังนี้ครับ

v = dP/dt = k3[ES] = k(-2)k1k3[S] [Eo]/ (k(-2)k(-1) + k(-2)k3 + k(-2)k1[S] + k1k2[S][S])
หรือ v = k(-2)k1k3[Eo]/ ((k(-2)k(-1) + k(-2)k3)/[S] + k(-2)k1 + k1k2[S]) {คูณด้วย (1/[S])/(1/[S])}
หรือ v = k3[Eo]/ ({(k(-1) + k3)/k1}/[S] + 1 + {k2/k(-2)}[S]) {คูณด้วย (1/{k(-2)k1})/(1/{k(-2)k1})}
หรือ v = k3[Eo]/ (K1/[S] + 1 + [S]/K2)
หรือ v = V/(1 + K1/[S] + [S]/K2) เมื่อ V = k3[Eo], K1 = (k(-1) + k3)/k1, และ K2 = k(-2)/k2…(A)

เราสมมติให้ V = 15 mM/h, K1 = 8.34, และ K2 = 1.85 แล้วสร้างกราฟเพื่อดูแนวโน้มเส้นโค้งอัตราการเกิดปฏิกิริยาที่ความเข้มข้นของสารตั้งต้นต่าง ๆ กัน

จากสมการ (A) เราสามารถหาสมการความชันโดยการหาอนุพันธ์อันดับหนึ่งที่ขึ้นกับ [S] จะ ทำให้ได้สมการ
dv/d[S] = V(1/K2 – K1/[S]²)/(1 + K1/[S] + K2[S])²
ที่ค่า v สูงสุด dv/d[S] = 0 ดังนั้น [S_max] = (K1K2)^0.5
และ v_max = V/(1 + 2(K1/K2)^0.5)

ในกรณีที่เรามีข้อมูลการทดลองและต้องการคำนวณหาค่า V, K1, และ K2 อาจทำได้สองวิธีครับ

วิธีที่หนึ่ง : คุณ TimeS ได้อธิบายไว้แล้ว คือพล็อต 1/v ในแกน Y และ [S] ในแกน X
จากสมการ (A) นั้นหลังจัดรูปใหม่เราจะได้
1/v = 1/V + (K1/V)(1/[S]) + {1/(K2V)}[S]….(B)
เมื่อ [S] มีค่ามาก ๆ จะทำให้ 1/[S] เข้าใกล้ศูนย์ และได้สมการเส้นตรง
1/v = 1/V + {1/(K2V)}[S]….(C)
เมื่อ 1/v = 0 เราจะได้ 1/V + {1/(K2V)}[S] = 0 เมื่อแก้สมการจะได้ว่า [S] = -K2 ที่ x-intercept
ส่วนค่าความชันของกราฟเส้นตรงนี้คือ 1/(K2V) = 1/(K2k3[Eo])
เราคำนวณ K1 ได้จาก minimum point โดยใช้สมการ [S_max] = (K1K2)^0.5

ตัวอย่างโจทย์

หลังจากที่พล็อต 1/v กับ [S] และแทรก Trendline สำหรับสมการเส้นตรงแล้วจะได้กราฟข้างล่างครับ

จากสมการ y = 0.03333x + 0.1577 เมื่อ y = 0; x = -4.731 = -K2 ดังนั้น K2 = 4.731
จากกราฟค่า [Smax] อยู่ที่ประมาณ 4.00 mM และ K1 = [Smax]²/K2 = 3.382
และ V = 1/(K2*ความชัน) = 1/(4.736*0.03333) = 6.341 mM/h

อย่างไรก็ตามเมื่อเราคำนวณค่า K1, K2, และ V แล้วคำนวณค่า v กลับมาใหม่จะเห็นจากภาพล่างว่า fitting ไม่ดี
นี่เป็นข้อเสียของวิธีกราฟฟิคครับ ซึ่งเราถูกหลอกตาด้วยการกลับค่า v เป็น 1/v ผมจึงไม่แนะนำให้ใช้วิธีนี้ แต่ให้ใช้วิธี
ของ least square จะทำให้ได้กราฟที่ fit ข้อมูลได้ดีกว่าครับ…

วิธีที่สอง : เรา set คอลัมน์ค่าทำนายอัตราการเกิดสารผลิตภัณฑ์ โดยทำ link ไปยังเซลล์ที่มีค่าของ V, K1, K2 ที่เราจะค้นหา และสร้างคอลัมน์ RSS (Residual Sum of Squares) หลังจากทำ search algorithm เรียบร้อยแล้วก็ทำ RSS Minimisation กระทั่งค่าความเปลี่ยนแปลงของ RSS น้อยกว่า 1E-6 ครับ และนี่คือผลการค้นหาและกราฟครับ ผมให้โปรแกรมเริ่มค้นหาที่ค่า V, K1, และ K2 เท่ากับ 5 จะเห็นได้ว่าเราได้คำตอบที่ใกล้เคียงค่าจริง และ fit ข้อมูลการทดลองได้ดีมากครับ

ดาวน์โหลดสมุดงาน EXCEL