GENERALIDADES SOBRE TERAPIA GÉNICA

 

EN QUÉ CONSISTE LA TERAPIA GÉNICA

En Enero de 1989 los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos aprobaron el protocolo clínico presentado por los Dres. Anderson, Blaese y Rosenberg para insertar un gen extraño en las células del sistema inmunitario de pacientes de cáncer. Aunque tal protocolo no representaba una terapia génica (TG) en sí misma, sin embargo las técnicas utilizadas eran idénticas a las requeridas para la terapia génica verdadera. Poco después, en Septiembre de 1990, se aprobó el primer ensayo clínico de auténtica terapia génica a los Dres. Blaese, Anderson y colaboradores: se trataba de introducir el gen que codifica para la enzima adenosin desaminasa (ADA) en niños que padecen una inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Son los llamados "niños burbuja". Poco tiempo después (Febrero 1991) se autorizó también el mismo tipo de TG en Italia (Dr. Bordignon y colabores en el Hospital San Raffaele de Milán). En 1995 ambos grupos de investigación publicaban los resultados de su experimentación clínica poniendo de manifiesto la eficacia de la técnica de TG ex vivo en los "niños burbuja". 

En un sentido estricto, por terapia génica humana (TG) se entiende la "administración deliberada de material genético en un paciente humano con la intención de corregir un defecto genético específico".  Otra definición más amplia considera la terapia génica como "una técnica terapéutica mediante la cual se inserta un gen funcional en las células de un paciente humano para corregir un defecto genético o para dotar a las células de una nueva función".

La TG se puede utilizar para curar enfermedades hereditarias  o enfermedades adquiridas. Originalmente, la TG trataba simplemente de corregir la deficiencia genética introduciendo en las células genes normales que realicen la función que no pueden llevar a cabo los genes defectuosos. Sin embargo, posteriormente se desarrolló otra modalidad de TG consistente en introducir en las células del paciente un gen especialmente diseñado para suministrar una nueva propiedad a las células. Tal es, por ejemplo, el caso de la aplicación de la TG para el tratamiento de pacientes infectados con el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA. Se trata de introducir en las células sanguíneas del paciente copias de un gen que obstaculiza la replicación del virus, frenando así el progreso de la enfermedad.

Pueden distinguirse, pues, varias estrategias dentro de la terapia génica:

-reemplazo de un gen defectuoso por uno funcional

-inmunoterapia

-inserción de un gen cuya proteína es capaz de transformar una molécula en citotóxica

-inducción de apoptosis

Algunas estrategias no requieren necesariamente de la inserción del gen en el genoma huésped, como por ejemplo, la inducción de apoptosis o la conversión de una molécula en tóxica para las células.

La TG se puede llevar a cabo en células somáticas (terapia génica somática) o en células de la línea germinal (espermatozoides, óvulos o las células que las originan) en cuyo caso se denomina terapia génica germinal. Es evidente que las alteraciones genéticas producidas en las células somáticas no se transmiten a la descendencia mientras que las modificaciones de las células germinales pueden transmitirse a las generaciones posteriores.

La TG puede realizarse por tres métodos distintos:

• Ex vivo, se basa en la obtención previa de células del paciente procedentes de un tejido u órgano de interés. Éstas son disgregadas y mantenidas en condiciones de cultivo de tejido in vitro, para luego ser transfectadas con el vector adecuado que contenga el gen terapéutico. Las células transfectadas son seleccionadas en función de su capacidad para expresar el gen exógeno de forma estable y persistente; posteriormente se amplifican y se recolectan con el fin de ser reimplantadas en el paciente. También se pueden utilizar líneas celulares alogénicas en aquellos casos en que el órgano o tejido no puede ser extraído con faciliddad o que ofrece dificultad de crecimiento in vitro(esta técnica se usa, por ejemplo, el síndrome de inmunodeficiencia combinada severa producida por deficiencia de la adenosin desaminasa, ADA, en los llamados "niños burbuja")

•     In situ, cuando la modificación genética de las células del paciente se realiza introduciendo el DNA (los genes terapéuticos) directamente en el propio órgano defectuoso del individuo (por ejemplo, en el caso de la fibrosis quística, la distrofia muscular de Duchenne). Este es el caso de la inducción de apoptosis en los tumores.

•         In vivo, se basa en la administración sistémica de la construcción génica de interés. El DNA puede ser administrado de forma directa, pero se suele recurrir a algún vector que facilite el proceso y permita la entrada y localización intracelular del vector es importante recurrir a vectores con destino específico dentro del organismo para permitir una entrega celular selectiva del gen sin requerirmiento de procedimientos traumáticos o quirúrgicos.Esta técnica puede realizarse, por ejemplo, por inyección intravenosa.

•         Otra posibilidad sería la de utilizar las células de la piel con un propósito bien distinto: la síntesis y secreción de proteínas que son producidas normalmente en un tipo de células pero que son transportadas en el plasma sanguíneo para uso de otras células. Así, en principio, implantes de células de la piel podrían corregir enfermedades tales como la hemofilia o las enfermedades de Alzheimer o de Parkinson.

Teóricamente, la TG puede realizarse de varias formas:

• por inserción génica, en la que se introduce en las células una nueva versión normal del gen defectuoso sin modificar.
• por modificación génica, en la que el gen defectuoso es normalizado por mutagénesis dirigida.
• por cirugía génica, en la que el gen defectuoso es sustituido por su versión normal.

El fragmento de DNA que quiere introducirse en el núcleo celular (transgén) obviamente ha de insertarse en el genoma huésped para ser estable, ya que si no ocurriera así, acabaría perdiéndose porque no contiene origen de replicación ni centrómeros, por lo tanto no puede replicarse por sí mismo. La inserción es un punto crucial, ya que suele darse al azar, con el riesgo que ello implica de que acabe afectando a algún/os gen/es de la célula. Existen estrategias para dirigir la inserción, como el colocar en sus extremos zonas homólogas al lugar al que se desea dirigirlo, pero de momento han demostrado un poco eficacia en general.

La expresión del transgén puede ser transitoria si no ha llegado a integrarse (típicamente dura unas 48 horas) o bien estable si ha logrado integrarse.

Aunque la sustitución de un gen por otro mediante un proceso de integración en el lugar específico por recombinación homóloga pueda llegar a ser una realidad en un futuro, por el momento no es posible aplicar con seguridad esta técnica en células humanas. Por ello, el nombre de terapia génica humana  hace referencia implícita a la ténica de inserción génica mencionada en primer lugar. Esta es la razón por la que sólo son susceptibles de tratamiento mediante la TG las enfermedades genéticas producidas por un gen recesivo, descartando, por tanto, las enfermedades determinadas por muchos genes o por anomalías cromosómicas. El que una enfermedad producida por un solo gen dominante sea, por el momento, intratable mediante TG se debe a que la enfermedad no es debida a la ausencia de una cierta actividad, sino a la síntesis de un producto dañino en las células del paciente, como sucede, por ejemplo, en la corea de Huntington. Para estos casos habría que diseñar una estrategia distinta.

En una situación ideal, la enfermedad debería ser curada de por vida mediante un solo tratamiento y sin que el mismo produjera efectos colaterales. Además, la inserción del gen en el cromosoma debería realizarse con total precisión; es decir, el gen normal o “terapéutico” debería reemplazar exactamente (por recombinación homóloga) al gen defectuoso o “enfermo”.

VECTORES Y MÉTODOS MÁS UTILIZADOS EN TERAPIA GÉNICA

La introducción del gen normal en las células humanas puede realizarse por medios físicos, químicos o utilizando virus como vectores. Los vectores son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen exógeno a la célula, facilitando la entrega y biodisponibilidad intracelular del mismo, de tal modo que éste pueda funcionar correctamente. Pueden clasificarse en vectores virales y no virales. Los vectores virales ofrecen ventajas como la especial capacidad para infectar células y facilitar la expresión de genes exógenos, pero presentan el inconveniente la respuesta inflamatoria y antiviral producida por el sistema inmunitario. Los vectores no virales son menos efectivos como sistemas de transferencia génica, pero ofrecen como principal ventaja la seguridad. Además, permiten que los genes puedan ser formulados como medicamentos, ser estudiados farmacológicamente y administrados al paciente de una forma dosis-dependiente. Todos los vectores tienen una meta en común: entregar el material terapéutico en las células. Sin embargo, la mayoría de semejanzas acaban ahí:

• Los primeros vectores retrovirales, basados en el virus de la leucemia de ratón, llevaban la información genética hasta las células en fase de mitosis. Sin embargo, no todas las células del cuerpo se dividen y ello implica por tanto limitaciones.

• Los Adenovirus, la misma clase de virus que causan los resfriados comunes, tienen un índice más alto de entrega del material genético, pero el sistema inmune descubre pronto su presencia y los elimina.

• Los Lentivirus, como el HIV, prometen incorporar el material genético dentro de las células, incluyendo también las que no se dividen, pero algunos científicos son escépticos a la hora de usar un virus mortal para propósitos terapéuticos.

• Los virus Adeno-asociados (AAVs), que causan enfermedades no conocidas en seres humanos, pero tienen el inconveniente de que son difíciles de producir en grandes cantidades.

• Los vectores no virales causan una respuesta inmune relativamente pequeña y pueden entregar trozos más grandes de DNA que la mayoría de los vectores virales. Aunque están limitados por su bajo índice de transferencia génica y por su pobre expresión a largo plazo, especialmente cuando se entregan in vivo.

Los investigadores de la terapia génica se esfuerzan para encontrar maneras de mejorar cada vector. Algunos afirman que no existirá un vector universal, sino una lista de vectores especializados, algunos para células divisibles y otros para no divisibles; algunos para los casos cuando se desea la expresión a corto plazo y algunos para las situaciones en que se desea la expresión a largo plazo; y algunos que entregan fragmentos grandes de DNA, mientras que otros llevan fragmentos más pequeños. Los investigadores tienen las pistas sobre qué vectores podrían ser eficaces contra ciertas enfermedades, pero no tienen las respuestas definitivas.

La siguiente tabla resume los métodos habitualmente usados en terapia génica:

-MICROINYECCIÓN:

Presenta una elevada eficacia (entre 1 y 10); típicamente se utiliza un micromanipulador cargado con un buffer y el transgén, para que la aguja deposite directamente éste en el núcleo. El inconveniente es que hay que pinchar célula por célula. Existen máquinas conectadas a ordenadores que permiten pinchar a muchas células simultáneamente, aunque su coste es elevado. Suele usarse para la producción de animales transgénicos porque en esas condicones sólo se requiere microinyectar a los pronúcleos en el cigoto.

-ELECTROPORACIÓN:

Muy usado actualmente, consiste en cultivar las células en un medio rico en iones para que sean capaces de transmitir la corriente eléctrica. Entonces se añade el transgén al medio, en forma lineal, y se somete a las células a un pulso eléctrico de gran intensidad y poca duración (del orden de milisegundos) con un aparato llamado electroporador. El pulso eléctrico induce la aparición transitoria de poros en la membrana celular, a través de los cuales traspasa el transgén.

-PRECIPITACIÓN CON FOSFATO CÁLCICO:

Poco eficaz; se trata de añadir el transgén al medio de cultivo, cuya concentración de fosfato cálcico y PH son controlados estrechamente para conseguir que el DNA precipite sobre la membrana celular y sea introducido por endocitosis constitutiva o pinocitosis. Se usa DNA en forma circular, lo cual provoca un gran problema, ya que el transgén sólo puede integrarse en forma lineal y ello ocurre al azar y en baja frecuencia. Además, frecuentemente el transgén presenta inversiones en su secuencia al ser linearizado debido a que puede romperse con facilidad. Un segundo problema es que la endocitosis conduce hacia la formación de vesículas prelisosómicas para acabar formándose lisosomas, en los que el DNA será degradado. Por tanto, la probabilidad de que el DNA escape a la degradación y se dirija al núcleo para integrarse es escasa.

-LIPOSOMAS:

Se trata de partículas esféricas de lípidos (micelas) que pueden contener líquido. Se fabrican con lípidos y un detergente en suspensión, el cual se va neutralizando para inducir la formación de las micelas, típicamente de fosfatidilserina. Para introducir el transgén, simplemente se añade a este medio y se espera a que se incorpore a las micelas. El diseño de los liposomas puede incluir también proteínas que dirijan los liposomas hacia determinados tipos celulares. Al tener naturaleza lipídica, los liposomas son fácilmente introducibles en la célula por endocitosis (que puede ser mediada por receptor si se han incluido las proteínas). Pero la cuestión de la vía degradativa lisosómica parecía también amenazar la eficacia de la técnica. Actualmente se utilizan liposomas inestables a PH ácido; esto se consigue, por ejemplo, incrementando la concentración de fosfatidilcolina. De esta manera, al disminuir el valor de PH en los lisosomas para activar las enzimas lisosomales, su estructura se disocia y el transgén es liberado. Asimismo, a pesar de que las enzimas lisosomales también son liberadas al citosol, no representan un peligro para la integridad celular, ya que son inactivadas por el PH neutro citosólico.

Su eficiencia de transfección es menor que la de los vectores virales. Además, si son inyectados, los liposomas son atrapados por los macrófagos, disminuyendo así su eficacia. Muchos investigadores han desarrollado técnicas para intentar superar estas limitaciones, que pasan por modificar la estructura del plásmido DNA en sí mismo, la estructura del complejo lipídico o bien mediante adición de ligandos que induzcan una endocitosis mediada por receptor más ventajosa. Es cierto que si logran escapar a la respuesta inmune y permanecer durante largos periodos de tiempo en circulación, los liposomas suelen extravasar en áreas con escapes en la vasculatura, tal y como suele aparecer en los tumores sólidos.

VENTAJAS DE LOS LIPOSOMAS

Admiten gran cantidad de DNA (minicromosomas artificiales).

Tienen poco efecto tóxico y presentan pocas reacciones inmunes en el organismo.

DESVENTAJAS DE LOS LIPOSOMAS

Son muy inestables, se descomponen una vez que penetran en la célula por lo que el DNA no alcanza el núcleo. Baja eficiencia de transfección. Con vistas a obviar estas dificultades se desarrollan en la actualidad los inmunoliposomas, que contienen anticuerpos covalentemente conjugados, los cuales son específicos para un determinado antígeno celular.

Los anticuerpos permanecen fuera del liposoma facilitando su función de diana tanto in vivo como in vitro.Estos liposomas son pH sensibles y, por tanto, se desestabilizan rápidamente a los pHs ácidos de los endosomas y lisosomas, de esta forma ocurre la disociación del liposoma y el ADN foráneo puede alcanzar el núcleo para su expresión. No obstante, en la mayoría de los casos, el liposoma es captado por el retículo endoplasmático (RE), impidiendo la llegada al núcleo del DNA foráneo.

Esto ofrece ventajas cuando se requiere introducir genes al RE (Por ej. en la enfermedad de Gaucher o de Nieman Pick); pero en la mayoría de los casos representa un problema, ya que no se logra la expresión del gen terapéutico. Una forma de obviar esto es la construcción de "armaduras" para el liposoma, es decir una cubierta que evite su toma por el RE, por ejemplo de polietilenglicol (PEG). De esta forma los liposomas sobreviven más tiempo en la circulación (vida media 2 días en lugar de 2 horas).

A pesar de los obstáculos que aún presentan, ya han sido utilizados en ensayos clínicos y son una herramienta valiosa en el suministro de genes in vivo.

-PLÁSMIDOS Y VECTORES CONJUGADOS

La manera más simple de realizar terapia génica es a inyección de DNA en un vector de expresión en la circulación y dejar que éste alcance el sitio específico de la patología y se exprese establemente.

De esta forma evitaríamos el empleo de los complicados y dañinos sistemas virales y los pacientes tratados no estarían sometidos a procedimientos quirúrgicos in vivo arriesgados y costosos. 

Hacia este propósito se han dirigido en la actualidad los trabajos de investigación en una serie de laboratorios. Por ejemplo se ha demostrado que en la célula de músculo esquelético es posible inyectar el DNA que codifica para la cloranfenicol acetiltransferasa CAT, la luciferasa o la beta-galactosidasa, manteniéndose la expresión de la proteína durante dos meses. Sin embargo, se observó que el éxito de este tipo de estrategia solamente se limitaba a la célula del músculo esquelético. Los vectores conjugados se basan en la formación de un complejo que posee dos dominios funcionales: uno de unión al DNA, compuesto de un polication (polilisina) y que a su vez se une a través de puentes disulfuros a un dominio que permite la unión a un receptor de la célula, por ejemplo, el receptor asialoglicoproteína, específico del hepatocito.

La alteración genética ex vivo de linfocitos o de células de la médula ósea intenta corregir el defecto en las propias células tratadas o en sus descendientes (linaje celular). Otros métodos alternativos que se están ensayando son, por ejemplo, el de inyectar directamente genes normales que codifican para la distrofina para tratar de curar la distrofia muscular de Duchenne o inhalar mediante pulverización con aerosol virus o liposomas portadores de genes normales que, una vez dentro de las células pulmonares, permitan curar la fibrosis quística.

Normalmente la terapia génica es un tipo de transgenia que inserta fragmentos de DNA, aunque también se pueden internalizar  genomas enteros o cromosomas, aunque éste no es su cometido real.

Las enfermedades hereditarias consideradas como primeras candidatas al tratamiento con terapia génica se ilustran en la siguiente tabla.