ORGANIZACIÓN DEL GENOMA
Todos los genomas de los diversos adenovirus tienen una organización similar, por ejemplo, los genes codificadores de funciones específicas se localizan en la misma posición dentro del cromosoma viral. Como ya se ha dicho, el genoma consiste en dsDNA lineal, con secuencias terminales relativamente cortas (100-140 pb), repetidas e inversas, que juegan un papel importante en la replicación del DNA. Las dos hebras de DNA son codificantes, siguiendo la tendencia general de los virus de compactación de la información, ya que la mayoría del genoma es codificante. Existe una proteína de 55KD covalentemente unida al extremo 5’ de cada hebra de DNA.
El genoma inlcuye una secuencia empaquetadora del tipo cis-acting (a unos cuantos cientos pbs del final del cromosoma) para direccionalizar la interacción del DNA viral con sus capsómeros.
El cromosoma porta cinco unidades de transcripción temprana: E1A, E1B, E2, E3 y E4; dos unidades de transcripción tardía: IX y IVa2; y una unidad muy tardía que es procesada para generar 5 familias de mRNAs tardíos (de L1 a L5), todos transcritos por la RNA polimerasa II. El cromosoma también contiene uno o dos (según el serotipo) genes VA, transcritos por la RNA polimerasa III. Por convención, el gen E1A se coloca en el exxtemo izquierdo del mapa genético; tras él, le siguen E1B, IX, mayor tardío, VA, E3, E4, E2 y IVa2.
La estructura compacta del core va abriéndose a medida que la infección avanza. Quizás la RNA polimerasa interacciona inicialmente con los promotores expuestos al final del cromosoma y esa transcripción provoca la abertura progresiva del resto de la estructura. Por ello, los genes E1A y E4 son los primeros en expresarse. Es evidente pues que la activación de cada unidad transcripcional se determina por su propia localización en el cromosoma, así como por la localización relativa de las demás unidades.
Los mRNAs resultantes de la transcripción son diferenciados por el proceso de splicing que sufren y, en algunos casos, por el uso de diferentes sitios poli-A.
Algunos de los productos proteicos generados a partir de la misma unidad de transcripción se relacionan parcialmente en su secuencia.
Muchas de las unidades de transcripción codifican series de proteínas con funciones relacionadas. Por ejemplo, la E1A codifica para 2 proteínas que activan la transcripción e inducen a la célula huésped a entrar en fase S; E1B codifica para dos proteínas que cooperan con los productos de E1A para inducir el crecimiento celular. La evolución ha agrupado de esta manera las diferentes funciones. Ello conlleva la ventaja de solamente requerir un elemento controlador de la transcripción para regular la expresión de múltiples polipéptidos que se necesitan simultáneamente para ejecutar una función concreta. Además, puede ser ventajoso para reducir la frecuencia con la que regiones que interaccionan funcional o físicamente se separan debido a recombinación.
| Fase: | Genes transcritos: |
| Immediate early | E1A |
| Early | E1B, E2A, E2B, E3, E4, algunas proteínas del virión |
| Late | Genes late |
SISTEMA GENÉTICO Y RECOMBINACIÓN
La mayoría de estudios genéticos utilizan Ad2 o Ad5. Los diferentes mutantes son reconocibles mediante su fenotipo de crecimiento y se generan por manipulación dirigida del DNA viral, quedando relegados los métodos basados en mutágenos químicos y físicos. La única limitación que presentan es su habilidad para propagarse, ya que nunca crecen suficientemente como para producir un stock. Sin embargo, algunos mutantes han sido escogidos por su crecimiento diferencial para analizar las consecuencias fisiológicas de las mutaciones. El rango de posibles huéspedes para algunos mutantes es bastante amplio. Se han creado líneas celulares complementarias de algunas mutaciones, como por ejemplo para los genes E2 y E4. La recombinación entre los adenovirus contribuye a su evolución y diversidad de serotipos; ésta solamente se da entre adenovirus pertenecientes a los mismos subgrupos y con tasa elevada de eficiencia para la recombinación homóloga en cultivos celulares. Los mismos fenómenos recombinatorios son observables en la naturaleza. Además, la recombinación entre virus de diferentes subgrupos parece haber mejorado a Ad4, quien muestra similaridades en sus secuencias de E1A y E2 con el grupo B de adenovirus y su gen codificador del hexámero está inmunológicamente relacionado con el mismo grupo. Sin embargo, el gen para la secuencia de la fibra proteica, así como sus características inmunológicas son más similares al grupo c de adenovirus. Por ello, un modelo sugiere el origen de Ad4 como producto de la recombinación entre los grupos b y c.
Una recombinación eficiente necesita del proceso de replicación del DNA, aunque no parece que el virus contenga genes que codifiquen para algún producto que actue específicamente en la recombinación. Parece ser que las fuerzas promotoras de la recombinación se hayan en las cadenas simples de DNA producidas en la replicación, las cuales son propensas a emparejarse formando dúplex de DNA. A pesar de que los adenovirus no introducen su genoma en el cromosoma huésped, este proceso se da durante la transformación. No se han identificado motifs específicos que sirvan de sitios de integración del DNA adenoviral dentro del cromosoma celular, aunque esta integración podría suceder gracias a la homología parcial de ciertas zonas. Las proteínas celulares que median este proceso de recombinación han sido parcialmente purificadas.
CICLO REPLICATIVO
Una vez más, los entudios se centran en Ad2 y Ad5 debido a su fácil crecimiento en el laboratorio y a su extensa colección de mutantes existente. Al estudiar el resto de serotipos, se ha probado que poseen unas estrategias de crecimiento similares. La replicación de todos los adenovirus es similar y ocurre en el núcleo celular.
Muchos estudios se han realizado mediante la inyección de adenovirus a células HeLa o KB a elevada multiplicidad de infección (>10 pfu/célula) de manera que todas las células sean infectadas sincrónicamente. Las células usadas derivan de tumorales y presentan ventajas como un fácil crecimiento en gran cantidad, fácil infección viral y soportando más crecimiento viral que células normales.
El ciclo replicativo se divide por convenio en dos fases separadas por la replicación del DNA:
Hay que recordar que separar las fases en temprana y tardía es simplemente una manera de descripción más cómoda, pero en la realidad estas fases pueden fácilmente solaparse.
Los productos genéticos de la fase temprana median los procesos de replicación, inducción de la progresión del ciclo celular, bloqueo de la apoptosis y antagonizan una gran variedad de medidas antivíricas. En células HeLa infectadas a elevada multiplicidad de infección, la fase temprana ocurre hacia las 5-6 horas, tras las cuales la replicación del DNA viral ya puede ser detectada. El ciclo se completa a las 20-24 horas, habiéndose producido unas 10.000 partículas víricas por célula más un exceso de proteínas de la cápside que no han sido ensambladas.
ADSORCIÓN Y ENTRADA
La unión a la superficie celular es mediada por la fibra proteica a través de su porción distal carboxilo-terminal, que se une a un receptor celular. Algunos anticuerpos específicos pueden bloquear esta unión y, por tanto, evitar la infección. La identidad del receptor celular aún se desconoce. Es posible diferenciar diferentes serotipos virales según el tipo de receptor al cual se unan. El acercamiento ocurre eficientemente a 0ºC, pero el resto de pasos en el proceso requieren energía que es inhibida a bajas temperaturas. La evidencia de que Ad2 se une a ciertos tipos celulares pero no consigue penetrar en ellos sugiere que tal vez se necesite una segunda interacción proteína-proteína para producirse la internalización. El acercamiento es un proceso lento, necesitando unas cuantas horas para ser máximo.
Las proteínas participantes en tal unión han sido identificadas como pertenecientes a la familia de las integrinas; éstas se unen específicamente a una secuencia arg-gly-asp (RGD) de los polipéptidos III de los pentámeros. La unión incluye a la proteína fibrilar y varios receptores celulares, entre los que se encuentran las moléculas MHC de clase I y el receptor adenovírico del virus coxsackie.
Tras la adsorción, el receptor de Ad2 es introducido mediante el proceso de endocitosis mediada por receptor, un proceso mediado por la interacción integrina-pentámero. El mecanismo mediante el cual esta interacción induce endocitosis no está claro, aunque es muy eficiente (el 80-85% de las partículas víricas unidas a la superficie celular acaba penetrando) y rápido (unos 10 minutos). Aproximadamente un 90% de las partículas víricas incluidas en los endosomas son transferidas con éxito hacia el citosol en unos 5 minutos. En este proceso es decisiva la base del pentámero y está mediado por el PH ácido del endosoma. Así las partículas escapan en la fase de endosoma temprano, antes de la formación del lisosoma.
Experimentos in vitro sugieren que los adenovirus son capaces de unirse a los microtúbulos de la célula y, en unos 40 minutos tras la penetración, aparecen en los complejos del poro nucleares. Esto sugiere que la transferencia del DNA viral ocurre a través de la membrana nuclear. Tras 120 minutos, un 40% de las partículas internalizadas han liberado su DNA de las proteínas virales, aunque se desconoce qué porción de ese DNA se haya dentro del núcleo.
Durante el proceso de internalización ocurre una separación secuencial de las diferentes partes que componen el virión, incluyendo la decapsidación de las partículas virales. Estos procesos pueden darse en ausencia de acidificación. Las señales de disociación son producidas por los pasos anteriores de estas reacciones en cascada.
Los componentes de la estructura de proteína-NA que es introducida en el núcleo no han sido descritos, aunque se sabe que la proteína V se separa del core antes de ser introducida. El DNA se convierte entonces en una estructura fácilmente digerible por DNasa I para generar fragmentos que forman un patrón similar al de la cromatina. Ello sugiere que quizás las histonas celulares replacen al polipéptido VII, el mayor constituente del core, antes de que el DNA vírico sea transcrito. Otros estudios afirman no detectar presencia de estructuras DNA viral-histonas celulares y sugieren que el genoma expresado está estructurado en forma similar a la de un cromosoma.
El DNA viral se asocia a la matriz nuclear a través de la llamada proteína terminal; esta interacción es determinante en el proceso de transcripción, ya que esta proteína estaría iniciando el programa de expresión de los genes virales al actuar como el primer producto viral funcional.
ACTIVACIÓN DE LOS GENES “EARLY”
Este grupo de genes induce tres procesos en la célula huésped:
Los tres procesos dependen del estado de activación del genoma viral. Las principales proteínas activadoras de los adenovirus están codificadas en el gen E1A, el cual es el primero en ser expresado, bajo el control de un promotor que incluye un elemento del tipo enhancer duplicado. E1A codifica dos mRNAs durante la fase temprana de la infección y tres más durante las fases más tardías. No se ha podido identificar la función exacta de estos mRNAs. Los dos inicialmente transcritos son idénticos, pero se diferencian mediante un proceso de splicing. Sus productos son similares, aunque difieren en la adición de un segmento de 46 aminoácidos en la región amino-terminal. Contienen tres regiones conservadas (CR1, CR2 y CR3), pero no muestran dominios de unión al DNA específicos de secuencia, ya que se unen a proteínas celulares y modifican su función. Su acción es claramente la de estimular intensamente la tasa de transcripción. Desde que se conoce que los productos de E1A pueden activar otros genes virales en trans, son conocidos como trans-activadores. Se unen a una gran variedad de factores de transcripción y proteínas reguladoras, además de unirse y activar específicamente el dominio TATA. La activación se media en parte por su habilidad de unirse a la llamada TATA-binding protein (TBP), que es la subunidad de unión al DNA del factor de transcripción auxiliar IID (TFIID). Parte de este mecanismo incluye al gen p53, el cual también se une a TFIID, pero para reprimir la transcripción. Pero la proteína vírica puede desplazar a p53 de TBP y activar la transcripción. Es importante conocer que la proteína E1A parece no poder activar la totalidad de dominios TATA.
Además de esto, las proteínas E1A también activan la transcripción mediante su unión a otras estructuras, como a los sitios de unión para factores que se unen upstream respecto al promotor basal, varios factores transcripcionales (YY1, AP1...), inducir la expresión de los genes virales VA.
A parte de E1A, se conocen otros dos productos tempranos que activan los promotores adenovirales: E4-17 (se une al promotor de E2) y E2F(se une a E4-17).
Generalmente, los genes tempranos permanecen activos durante la replicación del DNA, aunque su tasa de transcripción disminuye lentamente, en parte debido a la muerte celular. Existen procesos reguladores de este fenómeno, en los cuales parece ser que se implican proteínas virales acumuladas en respuesta a un evento activador y cuya función consiste precisamente en inhibir una continuación de esta estimulación de la transcripción. Entre estas proteínas se haya también E1A, que se une a varios enhancers y a una proteína llamada p300, además de inducir otros mecanismos.
Una vez que los mRNAs tempranos han sido sintetizados, se trasladan a polisomas unidos a mRNAs celulares y los desplazan a medida que la infección va avanzando.
ACTIVACIÓN DE LA CÉLULA HUÉSPED
La infección con adenovirus provoca la entrada de las células infectadas en la fase S del ciclo celular, creando el ambiente óptimo que conduzca a la replicación viral. La modulación del ciclo celular es función de las proteínas E1A mediante sus CR1, CR2 y los dominios no conservados amino-terminales. La clave para comprender los mecanismos de esta regulación reside en el estudio de otras proteínas que coprecipitan con las de E1A. Una de ellas es la pRB, producto del gen del retinoblastoma, quién regula la actividad del factor transcripcional llamado E2F, resultando en una activación de la transcripción. Los adenovirus poseen lugares de unión para E2F. pBR ha demostrado en los ensayos clínicos ser capaz de inhibir la continuación del ciclo celular, bloqueando a la célula en G1, debido a su habilidad para unirse con E2F. La actividad de pBR es regulada mediante fosforilación vía quinasa ciclina-dependiente, quién se encarga de fosforilar los residuos de serina y treonina de pBR. Una hiperfosforilación de pBR inhibe la formación del complejo pRB-E2F, revertiendo así el bloqueo del ciclo celular. Entre los genes que activa E2F libre se encuentran los de la enzima dihidrofolato reductasa (DHFR), la timidina quinasa, la timidilato sintetasa, la ribonucleótido reductasa, la DNA polimerasa alfa, c-myc, cdc2, c-myb y N-myc.
Asimismo, otras dos familias relacionadas con pRB son también capaces de unirse a E2F: p107 y p130, cuya función también parece ser la de inhibir la progresión del ciclo celular.
Al igual que en el caso de pRB, E1A es también capaz de unirse a p107 y p130 para disociar E2F, mediante sus dominios CR1 y CR2 respectivamente.
Igualmente, existen familias proteicas de E2F capaces de asociarse con los diversos miembros de las familias de pRB. En resumen, las proteínas E1A disgregan una serie de complejos formados por diferentes miembros de las familias de pRB, múltiples subunidades de E2F y ciclinas con sus quinasas asociadas. Estos complejos regulan normalmente la progresión del ciclo celular y la disrupción de E1A desregula el sistema de control, permitiendo que las células quiescentes comiencen sus síntesis de DNA subsecuente a la infección.
Existe otra proteína con capacidad de unión a E1A, es la llamada p300, cuyo dominio en E1A es responsable de la habilidad de las proteínas E1A para reprimir la función de una variedad de enhancers, incluyendo aquellos encargados del control del estado de diferenciación celular. Es posible que E1A se una a una gran variedad de miembros de familias de proteínas reguladoras de la transcripción. El complejo E1A-p300 induce a las células quiescentes a entrar en fase S.
p400 es la proteína más larga conocida que se acompleja con E1A, uniéndose en los mismos dominios que para p300, por lo que quizás podrían estar relacionadas.
La inducción celular hacia la fase S se debe a dos regiones de E1A: la que se une a miembros de la familia de pRB y la que se une a p300. Presumiblemente, las proteínas E1A emplean estos dos mecanismos simultáneamente para conseguir un efecto mayor, estimulando de alguna manera el paso del punto de control G2/M. Alternativamente, E1A podría estar modificando la función de pRB y p300 más que simplemente estar inhibiéndolas o bien podría adquirir la capacidad de unirse a otras proteínas desconocidas, que confirieran la capacidad de pasar el punto de control G2/M.
Al igual que E1A, la proteína E1B (55kd) también está implicada en el control del ciclo celular. Esta proteína puede unirse a la p53 (proteína supresora de tumor), quien regula la progresion de G1 a S. Como ya se ha explicado, p53 tiene un importante papel en el proceso del cáncer y elevadas tasas de expresión de esta proteína detienen a la célula entre las fases G1 y S. Específicamente, p53 induce la expresión del gen de WAF1 (o p21), quién detiene la progresión del ciclo celular, y también puede inducir al gen GADD 45, que se activa en presencia de DNA dañado. Elevados niveles de p53 pueden también inducir apoptosis, por ello E1A bloquea p53 indirectamente, ya que induce a que E1B se le una y la bloquee mediante un mecanismo que aún no ha sido esclarecido. La proteína Bcl-2 es también capaz de bloquear la represión transcripcional mediada por p53. Todo ello induce a pensar que el modo mediante el cual p53 es capaz de provocar apoptosis es precisamente bloquear el proceso de transcripción. La apoptosis es un ejemplo de respuesta celular a la infección que tiene el potencial de inhibir el crecimiento viral y bloquear así su diseminación por el organismo. Sin embargo, los adenovirus contienen un gen que bloquea eficientemente estas defensas celulares; de hecho, no es el único virus capaz de semejantes estrategias de propagación.
Pero la unión a p53 no solamente reprime el proceso de apoptosis, sino que también induce la activación de las células quiescentes. El proceso mediante el cual ocurre esto no está claramente entendido. El análisis de E1B mutantes ha revelado una estricta correlación entre la habilidad de E1B de bloquear p53 y la de cooperar con E1A en la transformación oncogénica de las células. Las proteínas adenovirales E1A y E1B son, ciertamente, oncoproteínas. Se cree que la acción antagonizadora de E1B sobre p53 se debe a que consigue enmascarar su dominio de activación (en N-terminal), ayudando así a desregular la progresión del ciclo. En contraste con E1A, la expresión de E1B no es suficiente para estimular a las células quiescentes a salir de su estado. Presumiblemente E1B colabora con E1A, convirtiendo su acción en mucho más efectiva al prevenir una inducción de apoptosis derivada de sus acciones.
REPLICACIÓN DEL DNA VIRAL
La replicación de Ad2 y Ad5 se produce después de unas 5 horas tras la infección de células HeLa con una multiplicidad de infección de 10 pfu/célula, gracias a su entrada en fase S. El proceso de replicación continúa hasta que la célula muere.
Las repeticiones invertidas terminales del cromosoma vírico sirven de orígenes de replicación. Los estudios in vivo apoyan el modelo de que la replicación de adenovirus puede dividirse en dos estados:
Entre las regiones repetidas inversas se localizan secuencias cis-acting. Han sido descritos tres dominios funcionales hacia las 51pd de las repeticiones:
Los dos últimos dominios no son absolutamente necesarios para la replicación del DNA de adenovirus, aunque incrementan la eficiencia de la iniciación. Existen factores celulares capaces de unirse a ellos: NFI (Nuclear Factor I) al B y NFII al C.
La proteína preterminal se une a la polimerasa y el complejo formado es capaz de hacerlo a secuencias específicas de doble cadena en el origen del dominio A. La proteína preterminal sirve de primer para la replicación, preservando la integridad de la secuencia terminal del cromosoma durante muchas rondas de replicación.
La elongación de la cadena requiere dos proteínas codificadas en los genes E2: la propia polimerasa y las proteínas de unión a cadena sencilla, además de una proteína celular: el factor nuclear II (NFII) La habilidad de síntesis de DNA está comprometida por la temperatura, ya que ésta afecta a las proteínas implicadas. NFII es más necesario para superar problemas tras la replicación que para el proceso de replicación en sí.
En definitiva, solamente son necesarios una serie de polipéptidos y un origen de replicación para desarrollarse ésta in vitro: para la iniciación (proteína preterminal, polimerasa, NFI y NFIII) y para la elongación (polimerasa, proteína de unión a DNA y NFII). El gen adenoviral E4 también parece codificar factores implicados en el proceso, aunque su papel es probablemente indirecto y se desconoce.
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