VECTORES ADENOVIRALES

De los cerca de 100 serotipos diferentes de adenovirus, unos 40 presentan tropismo por los humanos. Los serotipos más frecuentemente usados en terapia génica son los subgrupos C del 5 y el 2. El adenovirus serotipo 5 infecta normalmente las células del tracto respiratorio superior, haciéndolo por ello un buen candidato de uso contra las enfermedades epiteliales. Su popularidad como vector ha ido incrementándose durante los últimos años debido en parte a trabajos como los de Frank Graham, de la McMaster University. De echo, estos virus parecían ser relativamente “seguros” como vectores, si se tiene en cuenta que han sido usados durante muchos años como vacunas sin generar efectos secundarios. Los adenovirus son fácilmente manipulables y tienen la ventaja de infectar células que se estén o no dividiendo.

Los adenovirus son virus cuyo genoma (aproximadamente 36kb) está constituido por una doble cadena linear de DNA (ds DNA) y se divide en genes tempranos (E1 a E4) y genes tardíos (L1 a L5). Puesto que la capacidad del genoma adenoviral para dirigir la producción de adenovirus reside en las secuencias ubicadas en E1, las estrategias para producir vectores adenovirales consisten en eliminar dichas secuencias e incorporar en su lugar el gen terapéutico, generando así un vector adenoviral recombinante sin capacidad de replicación. Además, la eliminación del gen E3 proporciona aún más espacio que rellenar con el DNA exógeno, puesto que este gen no resulta necesario para el vector. En el lugar que han dejado los genes delecionados se inserta entonces un gen exógeno con su correspondiente promotor de regulación fuerte. Su amplificación se lleva a cabo utilizando una línea celular complementaria, conteniendo la secuencia E1 en su genoma. La introducción del vector en la célula diana se realiza gracias a la interacción de la fibra y el pentón del adenovirus con receptores específicos de la célula. El vector es internalizado por un mecanismo mediado por receptor y una vez en el endosoma se produce la lisis del mismo. Entonces, el DNA viral conteniendo el gen de interés es liberado al citoplasma para dirigirse hacia el núcleo, en donde permanecerá como un DNA extracromosómico (episoma), dirigiendo la expresión del gen terapéutico. Esto implica una disminución del riesgo de producirse una mutación por inserción, aunque también genera el problema de la limitación de la expresión del gen exógeno a poblaciones celulares que estén dividiéndose. Aunque, como se verá más adelante, esto no supone especial inconveniente en las terapias que se han desarrollado en la lucha contra el cáncer, ya que van dirigidas a eliminar la célula. También inducen respuesta inmune en el huésped contra las células infectadas, por ello, son más útiles en la terapia génica contra el cáncer que en la que pretenda introducir un gen sano en células mutadas con la esperanza de que lo incorporen indefinidamente. Un nivel reducido de expresión proteica viral es capaz de producir más respuesta inmune que los vectores retrovirus, por ello se han desarrollado los llamados gutless vectors, cuyas secuencias virales han sido eliminadas para evitar la expresión proteica viral, además de permitir la introducción de una mayor cantidad de genes exógenos.

El adenovirus nativo es capaz de contactar con las células gracias a la interacción con la proteína de la superficie celular llamada CAR. Un juego de proteínas de la familia de las aVb integrinas posibilita luego su entrada en el interior de la célula.

Los vectores adenovirales son eficientemente transducidos a las células receptoras tanto in vivo como in vitro y pueden hacerse crecer de rutina hasta 10exp.11 pfu/ml.

El uso de vectores adenovirales ha sido aplicado al tratamiento de varias enfermedades además del cáncer. Su uso también es útil para la comprensión de la biología básica de las células transfectadas.

El tratamiento mediante terapia génica del la modalidad hereditaria del enfisema pulmonar es una de estas aplicaciones. Consiste en transformar adenovirus con el gen correspondiente de la alfa-1-antitripsina, cuya función es bloquear la actividad proteolítica de la enzima elastasa. El uso más habitual de adenovirus como vectores se da en el tratamiento contra la fibrosis quística, una enfermedad muy extendida. Incluso los científicos se han imaginado creando adenovirus con el gen de la fibrosis quística para ser aplicados en forma de aerosoles. Aunque esto plantearía problemas que hay que considerar, ya que si el virus está en forma de aerosol, también podrá salir de los pulmones con la misma facilidad con la que entraría. Ello implicaría unos riesgos medioambientales para otros individuos difíciles de imaginar. Y, a pesar de que se pretende modificar los adenovirus para que sean menos infecciosos, estos vectores podrían plantear riesgos para la salud.

Otra aplicación de los vectores adenovirales es su uso como portadores del gen llamado CF (también se ensayan con este fin vectores retrovirales y lentivirales) para transportarlo a las células alveolares de los pulmones en el caso de la fibrosis quística.

El tipo de vector viral que los científicos persiguen sería uno inyectable, con tanta facilidad como se inyecta por ejemplo la vacuna de la gripe. Una vez desarrollado, el uso de la terapia génica contra el cáncer sería mucho más fácil.

VIRUS ADENO-ASOCIADOS (AAV)

Los llamados virus adeno-asociados son virus de la familia Parvoviridae que solamente son capaces de multiplicarse en células previamente infectadas por algún miembro de la familia Adenoviridae (y algunos herpes); es decir, son virus que podrían considerarse del tipo satélite, ya que no son capaces de causar una infección por sí mismos, aunque en este caso el término de virus satélite no es usado, ya que éstos son más propios de plantas y los huéspedes típicos de los virus adeno-asociados, por el contrario, son animales.

Los virus adeno-asociados se están desarrollando como vectores para terapia génica de varias enfermedades, por ejemplo, para introducir la copia funcional del gen llamado CF dentro del pulmón.

Una de sus ventajas es que, al igual que los retrovirus, los AAV pueden integrarse en el genoma huésped y permanecer allí durante un largo periodo de tiempo. Sin embargo, los genes que introducen acaban desactivándose a lo largo de las siguientes semanas o meses debido a la desacetilación de las histonas. Estudios han demostrado que esta inactivación puede evitarse mediante el uso de el fármaco llamado Trichostatin A, un inhibidor de la desacetilasa de las histonas.

EJEMPLOS DE CLONES DE VECTORES ADENOVIRALES

Es posible encontrar listas bastante extensas sobre los diversos vectores adenovirales que se van desarrollando para su uso en terapia génica. Buscando en internet se encuentra esta página web http://rvd.rtc.riken.go.jp/rvd/wais.html (Recombinant Adenovirus Database) que recoje una lista de 40 clones de adenovirus recombinantes, cuyos nombres comienzan por los prefijos “Ax-“ o bien “Ad-“ seguidos por un código de letras y números. Por ejemplo, se pueden leer nombres como:

1. V10112 Type: Recombinant Adenovirus Name of Clone: Ad5-F/gsK21MSH beta

Score: 43, Lines: 43, Bytes: 807

2. V10111 Type: Recombinant Adenovirus Name of Clone: Ad5-F/gsK21MSH alpha

Score: 43, Lines: 43, Bytes: 809

3.   V10138 Type: Recombinant Adenovirus Name of Clone: AxCAhp33

Score: 41, Lines: 45, Bytes: 793

4. V10137 Type: Recombinant Adenovirus Name of Clone: AxCAhFLIP

Score: 41, Lines: 45, Bytes: 795

Clicando con el ratón sobre el nombre de una cepa de virus aparecen todos sus datos:

APLICACIONES DE LOS VECTORES ADENOVIRALES EN LA LUCHA CONTRA EL CÁNCER

Los adenovirus son escogidos como vectores básicamente por dos razones: debido a su eficiencia de penetración en las células mediante endocitosis mediada por receptor y también porque resulta bastante fácil generar adenovirus recombinantes conteniendo la combinación de DNAs deseada. Así, han sido generados adenovirus portadores de genes supresores de tumores y genes de quinasas dependientes de ciclinas, como p53, p16/INK4A, p21/WAF1, p27/Kip1 y VHL. El uso de estos vectores posibilita un estudio de la acción de los genes supresores de tumores y el control del ciclo celular, el proceso de apoptosis, la angiogénesis y metástasis. Además, el uso de modelos animales permite evaluar el potencial de aplicación de estos vectores en la terapia génica del cáncer.

Sin embargo, no hay que olvidar que los virus poseen una extraordinaria capacidad de mutación que les confiere una enorme variabilidad; por ello, es necesario vigilar estrechamente los nuevos virus recombinantes que son creados con el fin de transportar un gen exógeno dentro de una célula, ya que pueden darse fácilmente recombinaciones homólogas entre varios virus recombinantes, los resultados de las cuales serían potencialmente peligrosos para nuestra salud y entorno. Esto ocurrió en un laboratorio en el que creaban adenovirus defectivos para E1A, portadores del gen humano B7-1 (Ad.ihB7-1). Resultó que los nuevos vectores eran portadores también de una secuencia inusual en 5’, que al ser caracterizada mostró ser el resultado de procesos recombinatorios homólogos y no homólogos entre diferentes genomas víricos.

Los virus oncolíticos que muestran replicación selectiva constituyen una nueva plataforma de tratamiento para el cáncer. Para aumentar la selectividad hacia las células tumorales, los investigadores diseñan continuamente virus con genes deleccionados, pero estas delecciones también reducen la potencialidad anticancerígena de los propios virus. Por ello, la búsqueda de modificaciones que conduzcan a solventar estos problemas es una cuestión muy presente en la investigación actual. En este trabajo se muestran varios ejemplos de esta mejora en la especificidad hacia las células tumorales, como es el caso del virus llamado Onyx-15 o el adenovirus deleccionado para E1A.

Adenovirus competentes en replicación (Ads) han sido usados para la viroterapia oncolítica desde su descubrimiento. Recientemente su uso se deriva hacia aquellos que son mutados y modificados genéticamente en el laboratorio, ya que de esta manera producen la lisis selectiva de las células tumorales.

Un ejemplo de estas manipulaciones implica al adenovirus tipo 5, cuyo genoma se ha introducido en dos virus defectivos cuyas mutaciones se complementan entre sí únicamente en ciertas células tumorales. El genoma de uno de esos dos vectores contiene solamente los mínimos elementos virales requeridos en cis para la replicación y encapsidación, además de los genes E1A bajo control de un promotor de una fetoproteína humana. Este vector “controlado” tiene una capacidad de transportar hasta 30 kb de DNA foráneo. El vector suplementario contiene todos los genes adenovirales, exceptuando el E1A. Ambos vectores se han diseñado para transportar genes reporter heterólogos, cuya expresión pueda ser detectada a través del tumor. La coinfección de células de hepatocarcinoma que tienen la capacidad de transcribir genes bajo el control del promotor de la fetoproteína humana, conduce a la lisis celular y a la copropagación. La diseminación oncolítica de estos dos vectores complementarios in vivo se ha demostrado mediante inyección intratumoral de células humanas de hepatocarcinoma en ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID). Este sistema ofrece seguridad y características de capacidad genética que pueden reperesentar una ventaja terapéutica frente la oncólisis por un único virus.

DETERMINACIÓN DEL USO APROPIADO DE LOS VECTORES ADENOVIRALES

Al plantearse el uso de vectores adenovirales en la terapia génica del cáncer, es evidente que el primer paso a realizar implica precisamente estudios sobre los posibles efectos adversos creados por los propios adenovirus, ya que si estos resultan comprometer la vida o salud del paciente, no podrían considerarse candidatos a posibles tratamientos en el futuro.

Un estudio realizado en este sentido utilizó 40 ratas encintas, que fueron transducidas con el vector AdV-CMV-Bgal a los 12 y 15 días de gestación vía intravenosa (1X10 (11) p.v totales) e intraamniótica (1X10(10) p.v totales) para estudiar los efectos toxicológicos del vector adenoviral en los embriones. Se realizó un análisis histológico de los fetos y los órganos de la madre (hematoxilina/eosina, X-gal/rojo rápido e inmunohistoquímica para adenovirus). A los 12 días de gestación se detectaron malformaciones debidas a la inyección intra-amniótica (pie zambo, cola superenrrollada, en gancho distal y comprensión fetal) y transducción en intestino medio fetal. A los 15 días de gestación se detectó transducción de la piel, boca y vías aéreas superiores e inflamación del cordón umbilical y seno subcapsular. En las ratas transducidas vía intravenosa, los embriones mostraron transducción de placenta, membranas amnióticas e intestino; y las madres transducción de cerebro, cuerno uterino, riñón, hígado, ovario, pulmón (cuadros neumónicos severos con macrófagos intra-alveolares y bazo). No se observó un asociación directa entre malformación y presencia del vector adenoviral. Los altos índices de citotóxicos en la madre vía intravenosa, podrían estar asociados con las cargas del vector administradas.

Asimismo, la respuesta inmune humoral contra los adenovirus limita la expresión intratumoral de los genes reporters transportadoes por los vectores adenovirales deficientes en su replicación y obstaculiza la eficiente transducción de células del huésped. Una estrategia para obtener una expresión génica persistente consiste en administrar el vector repetidamente. Sin embargo, los anticuerpos producidos por la inyección inicial del vector, impiden el uso de varios ciclos de terapia génica. Para determinar si la inyección intratumoral de adenovirus portadores de genes reporters induce, o no, la producción de anticuerpos en contra del vector, y establecer si la presencia de anticuerpos modifica la eficiencia de la expresión genética de los genes reporters, 45 ratonas  BALB/c  fueron inoculadas por vía subcutánea con 10e6 de células de cáncer de mama (TM-40D). Tres semanas después, 15 ratonas fueron inmunizadas por vía intratumoral con una dosis de 1X10e11 V/P de un adenovirus portador de la proteína verde fluorescente. Otros 15 animales fueron inoculados por vía subcutánea con la misma dosis del vector. El grupo control quedó constituido por 15 animales que recibieron una inyección subcutánea con buffer de fosfatos. Dos semanas después de la inmunización, los animales recibieron una inyección intratumoral con un segundo vector portador de la enzima luciferasa, con la finalidad de monitorear los niveles de expresión de la proteína reportera dentro del tumor, así como la diseminación del adenovirus a otros órganos. Dos, siete y catorce días después de la inyección de luciferasa, se sacrificaron 5 animales de cada grupo y se practicó extracción del tumor y diferentes órganos con la finalidad de realizar los ensayos de luciferasa e inmunofluorescencia. Asimismo, se recolectaron muestras de suero para el ensayo de ELISA y de anticuerpos neutralizantes. En los ratones preinmunizados con una dosis de adenovirus, se observó una  persistente sobreproducción de anticuerpos, la cual limita la efectividad de la transducción del vector y disminuye el grado de expresión de los genes reporters. Sin embargo, la disminución de la actividad de luciferasa a nivel sistémico fue 3 logs más alta que la disminución observada a nivel intratumoral. Aunque se observó una significativa reducción en el grado y duración de la  expresión génica en los animales preinmunizados. Esta observación sugiere que la presencia de anticuerpos circulantes en contra de adenovirus, obstaculiza la diseminación del vector y apoya la posibilidad de utilizar dosis crecientes de adenovirus  en animales preinmunizados, para lograr una elevada expresión de los genes de interés.

Antes de comenzar un ensayo contra un tipo específico de cáncer, los investigadores han de decidir si el vector que desean utilizar, en nuestro caso adenoviral, es ciertamente el adecuado para tal fin. Debido a que los adenovirus son causantes principalmente de infecciones respiratorias es lógico presuponer que les será mucho más fácil infectar células epiteliales, sobretodo si son del tracto respiratorio, aunque en la práctica se ha encontrado que los vectores adenovirales han podido usarse en una gran variedad de tipos celulares humanos y animales con bastante éxito. Existen ensayos dirigidos a comprovar la capacidad de los adenovirus para infectar con relativa eficiencia un determinado tipo celular. Uno de estos ensayos estudió la biodistribución y el patrón resultante de expresión transgénica tras la administración intravesical de un vector adenoviral portador del gen de la luciferada (AdLuc). Ratones hembra fueron administrados a 1 × 10⁹ or 5 × 10⁹pfu de AdLuc, mostrando tras el sacrificio expresión del transgén en el tejido diana tras tres días desde la administración. El DNA del vector se detectó mediante PCR específica, mostrando una diseminación escasa de éste a los tejidos circundantes.

INDUCCIÓN DE APOPTOSIS E INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL MEDIANTE VECTORES ADENOVIRALES

VECTORES ADENOVIRALES Y EL GEN SUPRESOR DE TUMORES P53

Las mutaciones del gen p53 son una alteración genética común en varios tipos de cánceres, especialmente en los de cuello y cabeza.

Una estrategia en el uso de vectores adenovirales contra el cáncer se centra el la inducción de apoptosis desde las propias células tumorales gracias a la introducción del gen p53, que como ya se ha dicho se encuentra ausente en la mayoría de los cánceres. Esta estrategia se presenta como una posible terapia de ayuda a los tratamientos tradicionales.

En este sentido, el hecho de que el adenovirus no integre permanentemente su genoma no resulta un inconveniente, ya que lo que se pretende en eliminar las células cancerosas. En este caso, el vector adenoviral se ha modificado genéticamente para evitar su replicación, es pues, un vector adenoviral recombinante y defectivo en replicación (rAd/p53). Concretamente, el virus carece de los genes E1a y E2b.

Se pretende que la transferencia del vector, a través de la membrana tumoral, reestablezca el control genético celular y sea el propio gen p53 quien destruya la célula vía inducción de apoptosis.

Este método ha sido aplicado a pacientes con cáncer de cuello, cabeza, ovarios y pulmones de manera bien tolerada. Una pequeña pero significativa proporción de pacientes demostraron beneficio clínico. Actualmente se ensaya el nivel II de su combinación con los tratamientos tradicionales para cada tipo de cáncer.

En un estudio realizado por un grupo científico, un total de 6-18 pacientes fueron inyectados intatumoralmente con el adenovirus portador de p53, siendo marcado el lugar de inyección para posteriormente realizar la confirmación histológica del tumor. Tras tres días de seguimiento monitorizado, se realizaron las correspondientes biopsias, que demostraron en su mayoría una ligera reducción de la masa tumoral.

PROTOCOLOS FASE I:

Los pacientes susceptibles de someterse al ensayo mediante inyección intratumoral del vector adenoviral recombinante portador del gen p53 han de se mayores de edad y, al menos, haber pasado las últimas cuatro semanas sin radioterapia.

El tratamiento consiste en una inyección del virus, seguida de la extirpación del tumor e inyección en la cavidad tumoral transcurridos cuatro días. El tratamiento puede ser repetido cada cuatro semanas en función de la eficacia que muestre. Los pacientes estarán bajo observación médica estrecha durante doce semanas.

Los objetivos del estudio son estimar la eficiencia de transducción del adenovirus p53, así como determinar la dosis máxima tolerada del mismo. También correlacionar el estatus del gen p53 en las células tumorales antes y después de la transducción, además de la respuesta inmune expresada contra el tumor.