TRANSFERENCIA DEL GEN P16 MEDIANTE VECTORES ADENOVIRALES
El gen supresor de tumor p16 codifica una proteína que inhibe la quinasa 4 ciclina-dependiente y su delección homóloga es común en el cáncer de mama humano. La transferencia del gen p16 ha mostrado ser eficaz en la inducción de inhibición del crecimiento tumoral de varios tumores humanos, como los de cerebro, pulmón, próstata y esófago. Sin embargo, la eficiencia del gen p16 para inhibir el crecimiento del cáncer de mama humano no ha sido estudiada extensivamente. Para examinar su función de supresión de tumor y su potencialidad en el tratamiento de cáncer de mama humano, se expresó el gen funcional p16 en un vector adenoviral para ser introducido en una línea celular de cáncer de mama que no expresaba la proteína p16. Se demostró que la expresión del p16 introducido podía bloquear la entrada de las células tumorales en la fase S del ciclo celular, induciendo apoptosis tumoral e inhibiendo la proliferación celular tanto in vitro como in vivo. Estos resultados sugieren qeu p16 es un gen con una potencialidad grande de uso en la terapia génica del cáncer de mama.
VIRUS TUMOR-ESPECÍFICOS: ONYX-015
Los más recientes estudios en el campo de la terapia génica del cáncer conducen a los laboratorios hacia la producción de vectores virales que puedan aplicarse activa y específicamente contra las células tumorales, sin necesidad de aplicarlos simultáneamente junto con otros tipos de tratamientos. Algunos laboratorios han diseñado virus capaces de dirigir su ciclo vital solamente hacia las células tumorales. Estos llamados virus oncolíticos actualmente incluyen algunos tipos virales.
Un estudio reciente de científicos norteamericanos en colaboración con homólogos ingleses está desarrollando lo que la prensa llama "el virus asesino". Además de eliminar tumores, el estudio de los mecanismos de actuación de este vector adenoviral ayuda a un mejor entendimiento en la biología del cáncer. Este agente ha mostrado resultados prometedores en pacientes con tumores de cabeza y cuello, pero también puede ser útil en el cáncer de colon, páncreas y ovario. Las pruebas clínicas con el adenovirus en combinación con la quimioterapia tradicional han resultado alentadoras.
El fármaco basado en un adenovirus modificado genéticamente es capaz de eliminar células tumorales, incluso de cánceres para los que no ha sido modificado.
Esta nueva perspectiva del uso de la terapia génica, al contrario de la visión más "clásica", no se basa en la sustitución de un gen deficiente por otro funcional, sino en la introducción de un gen que realice su función sin tener que integrarse en el genoma huésped, ya que el principal interés es eliminar la célula diana. Este es el caso de la compañía farmacéutica francesa llamada ONYX Pharmaceuticals, que ha desarrollado un vector adenoviral tóxico para las células tumorales. Los pacientes tratados con este método tenían cáncer de nasofaringe, boca y garganta, un tipo de cáncer muy doloroso que afecta a unas 500.000 personas anualmente en todo el mundo. Los tratamientos convencionales incluyen terapia de rayos, cirugía y quimioterapia. El virus construido se llama ONYX-015 y explota el que podría llamarse punto débil de las células cancerosas: el gen p53 mutado, ya que en aproximadamente el 50% de las células tumorales la proteína p53 no existe o no es funcional. La novedad importante de este estudio es que no intenta reponer el gen funcional para que éste realice su función de inducción apoptótica, sino que se trata de que el virus ataque a las células tumorales y las destruya de una manera muy específica, sin afectar a las células sanas. Esto es posible porque la compañía ha utilizado para elaborar el vector un tipo de adenovirus que en su forma modificada se replica solamente en células con p53 ausente. El virus se presenta bajo dos formas, una de ellas es susceptible de inactivar la p53 y multiplicarse en células normales; la otra es la que ha sido utilizada en la fabricación del vector. El adenovirus salvaje codifica una proteína llamada E1b, que inactiva la p53. En el ONYX-015 se ha suprimido el gen E1b y, por tanto, únicamente puede multiplicarse en células que carezcan de p53, es decir, la mayoría de células cancerosas.
En los tipos de cánceres tratados, la ablación quirúrgica y la radioterapia son las únicas intervenciones terapéuticas posibles, pero en la mayoría de los casos los tumores se reproducen y son mortales. El primer ensayo clínico de inyección de ONYX-015 decepcionó a los médicos porque sólo en un 15% de los pacientes se observó una mejora. En nuevo estudio, en cambio, se basa en la combinación del ONYX-015 inyectado junto a quimioterapia, tratamiento que ha producido un retroceso de más del 50% de masa tumoral en el 63% de los pacientes; además, en un 26,6% de los pacientes tratados la regresión fue total, lagrando hacer desaparecer tumores de 10cm de diámetro.
El ONYX-015, además, tiene la ventaja de que los efectos secundarios que presenta son muy bien tolerados por los pacientes, ya que se asemejan a los de un resfriado ligero. Así, ningún paciente del estudio tuvo que suspender el tratamiento a causa de transtornos derivados de la terapia.
El adenovirus bautizado ONYX-015 ha seguido ya alguna de las fases a las que todo ensayo clínico ha de someterse, concretamente se encuentra a punto para iniciarse la denominada fase III.
Pero el uso de estos adenovirus como vectores contra las células tumorales tiene también sus limitaciones, como es la accesibilidad del tumor, un factor que determina si éste es tratable o no, ya que solamente son susceptibles de ser tratados aquellos tumores en los que sea posible la inyección directa de los virus.
Este obstáculo puede ser generalizado a los vectores víricos en general, aunque existe otro problema que se asocia a los adenovirus: la respuesta inmune provocada por el propio ONYX-015. La inyección directa de los virus atenúa este problema, presentando la ventaja de concentrar el virus en el tumor y así exponerlo en menor grado al sistema inmunitario. Sin embargo, parece que la respuesta inmunitaria provocada por la terapia intratumoral no reduce el efecto terapéutico de la misma
Sus inventores esperan poder inyectar ONYX-015 por vía intravenosa en el futuro, incluso, afirman que ya se han iniciado ensayos clínicos en ese sentido. Actualmente se estudia el uso de este vector para tratar otros tipos de cáncer, como los pancreáticos y las metástasis hepáticas, ya que ambos son adecuados a las inyecciones directas.
En estudios de laboratorio se ha demostrado que ONYX-015 también es capaz de replicarse en células tumorales en las que p53 permanezca intacto, hecho que conduce a contemplar la acción de otro gen, el p14 ARF, que también podría estar alterado en el cáncer.
Respuesta al tratamiento con vectores adenovirales portadores del gen p53 (Ad-p53)
Los efectos creados por la introducción de la proteína p53 exógena dependen de las alteraciones moleculares relacionadas con las acciones de p53 en el control del ciclo celular y el proceso de apoptosis. El conocimiento del background genético de las células tumorales es crucial para el desarrollo de terapias eficientes basadas en la introducción de genes supresores de tumores.
En lo referente a la respuesta inmune generada en el organismo debido a la introducción de un adenovirus portador del gen p53, se realizó un estudio con diez pacientes de cáncer de pulmón avanzado que recibían mensualmente una inyección intratumoral de un adenovirus recombinante portador del gen humano p53, evaluó la respuesta inmune desarrollada contra los antígenos adenovirales y contra el transgén. La respuesta celular y humoral en los pacientes fue estudiada mediante la obsevación de la proliferación de los linfocitos y la aparición de anticuerpos de neutralización (Ab) contra los antígenos del serotipo 5 adenoviral, mostrándose un incremento significativo de ambos procesos. Sin embargo, no se observaron alteraciones consistentes en las respuestas humoral y celular contra los epítopos del p53 y no se generaron anticuerpos citotóxicos contra el cáncer de pulmón humano. Los pacientes sometidos a este tratamiento mostraron evidencias de una regresión tumoral prolongada y estable.
VECTORES ADENOVIRALES DEFECTIVOS PARA E1A CONTRA EL CÁNCER
Un equipo de investigadores ha identificado un adenovirus mutante para E1A, d/922-947, que se replica y lisa selectivamente un amplio rango de células cancerígenas con anormalidades en los puntos de control de sus ciclos celulares. Este mutante ha demostrado una inducción de fase S reducida y capacidad de replicación en células no proliferativas normales, así como una potencia relativa in vivo superior a la de otros adenovirus con delecciones génicas. En algunos tipos de cáncer, esta potencia se demostró superior también a la del adenovirus salvaje. Su administración intravenosa redujo la incidencia de metástasis en un modelo de cáncer de mama. Por ello, este vector adenoviral muestra una prometedora potente replicación selectiva de utilidad para el tratamiento local y sistémico del cáncer.
TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER MEDIADA POR CTS1
Recientemente ha sido diseñado un derivado del gen p53, llamado supresor de tumor quimérico (CTS1), en el cual los dominios p53 que se conoce median la inactivación de p53 han sido eliminados. Un estudio realizado para evaluar la la actividad de un vector adenoviral-CTS1 en comparación con la actividad de un vector adenoviral-p53 en varias líneas tumorales in vitro, mostró una mayor eficiencia del CTS1 (P>0.1), en términos de inhibición del crecimiento celular. Este resultado fue confirmado in vivo mediante modelos tumorales en ratones. El vector portador del gen CTS1 muestra una mayor eficiencia para inhibir el crecimiento celular en modelos de osteosarcoma, en comparación con el vector portador de p53. Tanto in vivo como in vitro, esta elevada inhibición del crecimiento celular se ve correlacionada con una elevada inducción de apoptosis. Además, CTS1 es un gen supresor de tumor potencialmente mejorado para el tratamiento de tumores humanos resistentes a la terapia génica tradicional del p53.
TRANSFERENCIA GÉNICA DEL GEN N5 MEDIADA POR VECTORES ADENOVIRALES
La terapia génica diseñada para iniciar las vías apoptóticas celulares implica el prerrequisito de conocer los distintos caminos apoptóticos. Aunque las vías apoptóticas iniciadas por receptores de superficie celular, como el factor de necrosis celular 1, están bien caracterizadas, no ocurre lo mismo con las vías que implican receptores nucleares en respuesta al estrés genotóxico. El dominio nuclear que contiene la proteína p84N5 puede inducir apoptosis tras su trasferencia a las células; esto sugiere que quizás juegue algún papel en alguna vía apoptótica iniciada nuclearmente. Para probar la posibilidad de que N5 pueda ser usado en terapia génica del cáncer, se han generado adenovirus recombinantes que expresan N5 y se han estudiado los efectos de la infección viral en el crecimiento y tumorgenicidad de las células tumorales. La infección con adenovirus-N5 redujo significativamente la proliferación y tumorgenicidad del cáncer de pulmón, de ovarios y osteosarcomas en líneas celulares mediante inducción de apoptosis, tal como indicó la fragmentación del DNA en las células infectadas. Los resultados sugieren que los adenovirus-N5 son candidatos para la terapia génica del cáncer.
Por otro lado, el factor de transcripción E2F-1 juega un papel crucial en la regulación de la progresión del ciclo celular a través de G1/S. Su actividad se modula por un complejo que incluye la proteína del retinoblastoma (pRB) y otras proteínas relacionadas. Una sobreexpresión de E2F-1 induce apoptosis en células fibrobláticas quiescentes. Se ha construido un adenovirus recombinante con E2F-1 para estudiar como esta sobreexpresión es capaz de inducir apoptosis en carcinomas de cabeza y cuello. Para ello se usaron dos líneas celulares, Tu-138 y Tu-167, ambas con mutaciones de p53, pero expresando diferentes niveles de la proteína pRB. Tras la infección con adenovirus-E2F-1, ambas líneas celulares mostraron niveles de expresión elevados de E2F-1 y activaron una construcción génica que contenía un gen reporter de la cloranfenicol-acetiltransferasa y un motivo de unión a E2F-1. Ensayos de crecimiento in vitro mostraron que la supresión del crecimiento celular mediada por la proteína E2F-1 fue efectiva en ambas líneas celulares. La fragmentación del DNA celular y los análisis con deoxinucleotidil transferasa terminal indicaron que se había inducido apoptosis en las células infectadas con AdCMV-E2F-1. Además, los experimentos ex vivo mostraron supresión total del crecimiento tumoral en los lugares que recibieron células infectadas con AdCMV-E2F-1. Análisis in vivo en modelos animales también demostraron la misma inducción apoptótica. Esto indica que la sobreexpresión de E2F-1 mediada por vectores adenovirales suprime el crecimiento de tumores de cabeza y cuello tanto in vivo como in vitro mediante inducción de apoptosis.
ADENOVIRUS Y EL ONCOGÉN K-RAS
El cáncer pancreático humano suele mostrar una elevada incidencia de mutaciones del oncogén K-ras. Tales alteraciones pueden usarse como destinos potenciales para ribozimas específicas (Rz) anti-K-ras como sistema inhibidor del crecimiento tumoral. Un equipo de investigadores ha diseñado una anti-K-ras Rz contra los transcritos mutantes para K-ras y ha generado un adenovirus recombinante (rAd) que expresa esta ribozima (rAd/anti-K-ras Rz). Con él se infectó más del 95% de una línea pancreática humana a una dosis de 200 pfu/célula. El virus diseñado suprimió significativamente los mutantes para K-ras e inhibió el crecimiento de las células infectadas. Tres días tras la infección, se observó una supresión de crecimiento máxima y rasgos morfológicos característicos de apoptosis como condensación nuclear, fragmentación del DNA oligonucleosomal, además de supresión de la oncoproteína bcl-2. Estos cambios no fueron observados en las células infectadas del grupo control
Una función anormal del gen Ras también se implica en la carcinogénesis y progresión del cáncer de vejiga. Para intentar encontrar un tratamiento eficaz vía terapia génica, los investigadores han ensayado con vectores adenovirales portadores de la versión mutante H-ras (N116Y) contra células tumorales de cáncer de vejiga implantadas en ratones. Para comprobar su eficacia, se compararon los resultados obtenidos con los de un grupo de ratones control, que fue inyectado con adenovirus defectivos en replicación portadores del gen de la beta-galactosidasa. Los vectores terapéuticos portaban el gen H-ras bajo el control del promotor CMV (AdCMV-N116Y). Los efectos de ambos vectores se estudiaron in vitro en dos líneas celulares de cáncer de vejiga, para luego aplicarse a las células cancerígenas implantadas en los ratones (1 x 107 células cancerígenas por ratón hembra) en una dosis de 1 x 109 pfu/100 µl AdCMV-LacZ o AdCMV-N116Y administrada transuretralmente. Los ensayos de crecimiento in vitro demostraron una supresión del crecimiento tumoral en las células tratadas con AdCMV-N116Y respecto a las tratadas con AdCMV-LacZ. Los estudios in vivo mostraron una reducción significativa de las dimensiones del tumor y del número de células cancerígenas implantadas en el mismo grupo de ratones.
COINFECCIÓN CON VECTORES ADENOVIRALES PARA INDUCIR LA VÍA APOPTÓTICA
Se han desarollado varias estrategias terapéuticas para inducir apoptosis en las células de glioma, pero estas son frecuentemente impedidas por varios mecanismos anti-apoptóticos. Por este motivo, se intentan desarrollar nuevas técnicas que superen la resistencia a la apoptosis que presentan las células de glioma. Una de estas técnicas implica a los vectores adenovirales. Hasta la fecha, las vías apoptóticas mediadas por p53 y Fas han mostrado ser diferentes. Es posible desarrollar una terapia génica que combine los efectos pro-apoptóticos de las dos vías usando adenovirus recombinantes (Advs) para p53 y el ligando Fas (FL) (Adv-p53 y Adv-FL respectivamente). Para ello se realiza la transfección de p53 a dos líneas celulares de glioma (A-172 y U251) mediante una sobreexpresión de Bax, una proteína que induce una permeabilidad transitoria; simultáneamente la transfección conlleva una sobreexpresión de Fas. Para intesificar la apoptosis mediada por Fas, se puede transferir el gen FL conjúntamente con el p53 vía transducción mediada por adenovirus a las células de glioma. Las líneas celulares son relativamente resistentes a la infección aislada de Ad-p53 o de Ad-FL, pero la coinfección de las mismas (a una multiplicidad de infección sobre 100 de 8.5 ± 0.7% para Ad-p53 y de 3.0 ± 0.1% para Ad-FL) resulta en un drástico incremento del porcentaje de células apoptóticas similar en ambas líneas celulares. Por ello, podría considerarse la posibilidad del uso de la coinfección en ciertos casos para superar las barreras anti-apoptóticas que se presentan en la terapia génica contra el cáncer.
RESTABLECIMIENTO DE UNA FUNCIÓN GÉNICA MEDIANTE VECTORES ADENOVIRALES
VECTORES ADENOVIRALES Y EL GEN P53
Como ya se ha explicado, las mutaciones de p53 son alteraciones comunes en el cáncer humano, por ello se ha desarrollado la transferencia génica del gen funcional p53, que revierte la pérdida de la función normal tanto in vitro como in vivo. En una primera fase se aplicó la inyección intratumoral de un vector adenoviral defectivo en replicación portador de la versión normal del gen p53 para el tratamiento de melanomas metastásicos y cáncer de mama con mostrada inmunoreactividad de p53 en las biopsias pre-tratamiento. La actividad biológica de p53 inyectado se siguió mediante PCR del tejido tumoral. Un total de seis pacientes (cinco con melanoma y uno con adenocarcinoma de mama) fueron tratados con dosis dependientes del tamaño del tumor. Cinco de ellos mostraron resultados positivos después de algunos días tras la inyección del adenovirus portador del p53. Todos los pacientes desarrollaron anticuerpos contra los adenovirus. No se encontró una correlación evidente entre la incidencia y severidad de las reacciones adversas y las dosis inyectadas. La terapia génica del p53 mediante inyección intratumoral de un vector adenoviral defectivo en replicación en segura, fácil y biológicamente efectiva (con respecto a la frecuencia de transducción) en pacientes con melanoma metastásico o cáncer de mama.
Las mutaciones del gen p53 son también las anormalidades genéticas más frecuentes en los sarcomas de muchos tejidos, cuya tasa de mortalidad es del 50%; por ello, se investigan los posibles efectos beneficiosos que la restauración del gen normal pueda generar en la lucha contra este tipo de cáncer. Una vez más, los adenovirus se han convertido en los vectores usados para este fin. Un ejemplo de ello es el llamado Ad5p53, cuya delección radica en los genes E1A y, por tanto, es deficiente en replicación. Este vector expresa el cDNA del promotor del citomegalovirus portador del gen funcional p53. Con él se infectaron células humanas de sarcoma mutadas puntualmente para p53 a una dosis de 10-500 pfu/célula. La administración in vitro del vector produjo una inhibición del crecimiento del 40-60% en los días 4, 6 y 8 tras el tratamiento, en comparación con células infectadas con virus control y células no tratadas (P<.05 en el test T de Student). El estudio in vivo, por inyección intratumoral de los vectores a 6 × 109 PFU, resultó en un retraso del crecimiento tumoral de 35 días y en una regresión tumoral completa del 40% de los animales (P<.05 en el test T de Student). La expresión del mRNA del p53 de origen viral fue detectada en los tejidos tratados mediante PCR usando transcriptasa inversa. Todo indica que la restauración de la función del gen p53 retarda el crecimiento tumoral y podría ser útil para el tratamiento clínico del cáncer.
VECTORES ADENOVIRALES Y EL GEN DEL RETINOBLASTOMA (RB)
Estudios recientes han utilizado vectores adenovirales para atacar a las células del retinoblastoma, que como ya se ha comentado anteriormente, se caractarizan por una pérdida del gen funcional Rb, implicado en el control del ciclo celular. Estos vectores se han diseñado para llevar el promotor de E2F, el factor del transcripción al qual la proteína pRB funcional inhibe. La razón para realizar la terapia génica con este promotor es que se ha demostrado que en los gliomas, al no haber pRb, tienen el promotor E2F mucho más activado que los tejidos normales. Se esperaba que los promotores insertados redujeran las tasas de expresión hasta niveles normales. Esto sucedió en lineas celulares de glioma en cerebros de rata, en las cuales el virus portador del promotor pareció tener una expresión selectiva, mientras que virus no portadores del promotor demostraron expresarse sin especificidad alguna a lo largo de todo el cerebro.
INDUCCIÓN DE CITOTOXICIDAD MEDIANTE VECTORES ADENOVIRALES
VECTORES ADENOVIRALES Y EL GEN BAX
El gen bax juega un rol crítico en la inducción de apoptosis y su expresión mediante transferencia génica puede ser evaluada en relación al tratamiento de muchas enfermedades relacionadas con la apoptosis, como el cáncer. Sin embargo, la construcción de un vector adenoviral portador del promotor constitutivo del gen bax no es demasiado sencilla, presumiblemente debido a la elevada actividad pro-apoptótica de los genes. Se ha desarrollado un sistema de cotransferencia del gen bax mediante vectores adenovirales, los cuales contienen en su interior la secuencia cDNA del gen bax humano, conducida por un promotor sintético consistente en cinco sitios de unión a GAL-4 y una TATA box (GT). Este vector demostró unas bajas tasas de expresión en cultivos de células mamarias y, en cambio, unas tasas elevadas de expresión al ser transferido a las células tumorales. El vector ha de expresar la proteína de fución GAL-4/VP16. Tras la inducción del gen bax en las células de carcinoma del pulmón se observó una extensa apoptosis. Esto sugiere que el sistema regulador de la GAL-4 ofrece una alternativa de construcción de vectores adenovirales que expresen genes potencialmente citotóxicos.
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