USO DEL PROMOTOR DE LA SOMATOSTATINA EN TERAPIA PRO-CITOTÓXICA
La oncoproteína celular codificada en el oncogén del sarcoma de Ewing (EWS)/factor activador de transcripción 1 es un marcador específico para el melanoma maligno de los tejidos blandos (MMSP) y es un potente activador de algunos promotores inducibles por cAMP, inlcuyendo el promotor de la somatostatina. El potencial del uso del promotor de la somatostatina para dirigir una expresión génica tóxica en las células MMSP ha sido estudiado mediante la introducción de un vector herpes simplex portador de la fusión génica somatostatina-timidina quinasa en células MMSP, se produce una fuerte sensibilidad específica hacia la droga citotóxica ganciclovir. La sensibilidad a ganciclovir requiere la presencia del sitio de unión ATF en el promotor de la somatostatina, indicando que la expresión génica tóxica es causada por EWS/ATF1. La eficacia de vectores adenovirales recombinantes en las dos líneas celulares MMSP ha sido estudiada también, mostrando sorprendentemente que varios promotores (incluyendo el de la somatostatina) que son fuertemente activados por EWS/ATF1, no son activados en cambio en presencia de vectores adenovirales. Ello implica que la primera generación de vectores adenovirales no pueden ser usados como vehículos promotores de expresión génica citotóxica en células MMSP.
ALTERACIÓN DE LA QUIMIOSENSIBILIDAD A LAS DROGAS CAUSADA POR TRANSFERENCIA DEL GEN P53 MEDIANTE VECTORES ADENOVIRALES
Algunos estudios en la terapia génica del cáncer implican el uso simultáneo de vectores adenovirales portadores del gen p53 humano (AdCAp53)y distintas drogas anticáncer. Un ensayo usó las líneas celulares de carcinoma pulmonar llamadas NCI-H157 y NCI-H1299 para probar diversas soluciones conteniendo agentes anticancerígenos a diversas concentraciones tras la inyección previa de las soluciones de adenovirus recombinantes. La actividad anticancerígena fue evaluada tras 5 días de incubación mediante el cálculo de curvas de respuesta dosis-dependientes. Los agentes que mostraron una mayor efectividad en las células NCI-H157 fueron cisplatina (CDDP), 5-fluorouracil (5-FU), bleomicina y 7-etil-10-hidroxi-campotecina (SN-38); en cambio, ciclofosfamida y paclitaxel mostraron una baja efectividad. Basándose en estos datos, se estudió la interacción entre AdCAp53 y algunos agentes anticancerígenos. En este sentido, se observó un efecto suplementario de 5-FU y SN-38 en células NCI-H1299. Ninguna otra droga mostró más efectos aditivos al ser inoculada junto a AdCAp53. Estos resultados indican la potencialidad de ambas drogas para ser usadas en la terapia de restablecimiento de la función del gen p53 en células tumorales in vivo.
INDUCCIÓN DE CITOTOXICIDAD MEDIADA POR ADENOVIRUS DEFICIENTES EN E1B 19-kDa Y 55-kDa EN CÉLULAS MALIGNAS HUMANAS
El gen adenoviral E1A posee un efecto antitumoral y puede inducir sensibilidad al tratamiento con agentes que dañan el DNA. En cambio, las proteínas de 19-kDa de E1B inhiben la apoptosis mediada por E1A y las de 55-kDa inactivan la proteína p53. Se han estudiado los efectos producidos in vivo e in vitro por adenovirus defectivos para las proteínas de 19-kDa y 55-kDa en algunas líneas celulares tumorales malignas humanas. Para ello se usaron fibroblastos no tumorgénicos y líneas tumorales provenientes de cáncer de mama, de cérvix, de colon, carcinomas epidérmicos y osteosarcomas, infectándolas a una multiplicidad de infección de 20 pfu y evaluando la viabilidad mediante el método de cristal violeta. Se analizó la tumorgenicidad celular antes y después de la inyección de los adenovirus. La viabilidad tras 72 horas pasó a ser de un 70 a un 93% para wtAd y del 11 al 20% para H5dL118; en los estudios in vivo, se detectó una total inhibición de la tumorgenicidad; cuando el mutante H5dL118 fue inyectado intratumoralmente, se detectó una disminución parcial y transitoria de la tumorgenicidad. Los resultados de este estudio indican que una infección con adenovirus mutantes deficientes en E1B genera un marcado efecto citopático en las células tumorales que el generado por la versión salvaje del virus (wt). Además, la inyección del adenovirus defectivo induce un efecto de supresión tumoral in vivo.
INMUNOESTIMULACIÓN ANTI-TUMOR MEDIANTE VECTORES ADENOVIRALES
Muchos estudios han intentado incrementar la cantidad y citotoxicidad especifica de los linfocitos que reaccionan con las células tumorales. Los primeros intentos incluían el marcaje de unas células inmunes llamadas linfocitos de infiltración tumoral (TILs, tumor-infiltrating lymphocytes) para seguir el progreso del tratamiento contra el melanoma maligno. El enfoque adoptado por los investigadores reconoce las limitaciones del recurso a fuerzas externas (radiación, quimioterapia y cirugía) con los pacientes cancerosos y propone una estrategia basada en los propios mecanismos internos del cuerpo, como la terapia génica, para conseguir que el propio cuerpo rechace la enfermedad.
En un primer ensayo, los TILs fueron introducidos en una solución de interleuquina-2, que potencia su efecto destructor, y posteriormente expuestos a retrovirus de leucemia de ratón manipulados. El sistema de transporte y distribución había sido neutralizado y dotado mediante técnicas de ADN recombinante con un gen humano. Este gen codifica un factor de necrosis tumoral (TNF), una proteína que interfiere con el suministro de sangre al tumor y debilita las células tumorales. Los virus alterados se insertan ellos mismos junto con su gen exógeno dentro del material genético de los TILs, y estos son inyectados en la sangre de los pacientes con melanoma. Conforme a las previsiones, los TILs activados se hospedarían en los tumores como si fuesen misiles teledirigidos, atacando las células cancerosas y a la vez liberando el factor antitumoral (tóxico) para ayudar a exterminarlos.
Pero fallaron varios aspectos importantes en los años de experimentación. Aunque los TILs sí se dirigían al tumor, no lo hacen los modificados con el TNF. Parece que algo relacionado con la inserción del TNF interfiere con su capacidad para hospedarse en el tumor. El resultado es que la mayor parte de los linfocitos modificados quedan atrapados en el hígado, bazo y pulmones, donde probablemente son destruidos. Y la expresión no regulada en estos órganos del TNF puede originar procesos tóxicos secundarios.
Otro método basado en la inmunoterapia ("vacunación genética" o inmunoterapia activa) trata de aumentar el carácter extraño de las células tumorales para estimular la acción antitumoral de los linfocitos T y macrófagos del sistema inmunitario. Las células tumorales producen en su superficie unas proteínas anómalas capaces de activar las células asesinas. Algunos tumores incluso son portadores de antígenos propios ("antígenos asociados a los tumores") que permanecen "silenciosos" en las células normales. Esto ocurre con productos génicos descubiertos en algunos melanomas humanos, las proteínas MAGE (melanoma antigen) y MART (melanoma antigen recognized by T-cells) descubiertas recientemente. Normalmente, los antígenos son presentados a las células inmunitarias en forma de fragmentos por las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) presentes en las superficies de las células. Pero una de las diferencias fundamentales entre las células normales y las tumorales está en que estas últimas no presentan correctamente los antígenos tumorales. Esta es una de las características que se pretenden modificar.
Mediante modificación genética se intenta potenciar la respuesta inmunitaria dirigida contra el tumor. Se utilizan diversas proteínas específicas, especialmente citoquinas y moléculas de adhesión celular (interleuquina-2, interleuquina-4, el TNF, etc.) que no producen ningún efecto sobre el crecimiento de las células tumorales in vitro pero inhiben el crecimiento del tumor in vivo. En ratón, las células tumorales son eficazmente rechazadas cuando han sido manipuladas mediante técnicas de ingeniería genética para expresar diversas citoquinas o bien el complejo principal de histocompatibilidad. Esto hace pensar que en humanos, el protocolo debería incluir la eliminación de una parte del tumor, la transducción de las células in vitro con las formas de expresión adecuadas y el reimplante de estas células tumorales al paciente. Se han aprobado diversos protocolos clínicos en todo el mundo para la transferencia in vitro a células tumorales de genes de citoquinas (IL-2, IL-4, el interferón g , el GM-CSF o factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos, etc.) para diferentes tipos de cáncer: colorrectal, de mama, melanoma maligno, neuroblastoma, carcinoma de pulmón, de riñón, etc.
A continuación se presentan diversas estrategias basadas en vectores adenovirales.
USO DE VECTORES ADENOVIRALES PORTADORES DE INTERLEUCINAS HUMANAS PARA ESTIMULAR LA RESPUESTA INMUNE DEL HUÉSPED
Existen grupos de investigadores trabajando en el análisis de nuevas sinergias en el uso de vectores adenovirales. Se ha comprobado que, si en lugar de infectar el tumor, se extraen células dendríticas del animal caracterizadas por tener una gran capacidad de estimular la respuesta inmune- y se infectan ex vivo con adenovirus que contengan el gen de la interleucina 12, para inocularlas luego en el tumor, se producen respuestas inmunes antitumorales muy intensas; además, con poca dosis de IL-12 se consiguen resultados antitumorales potentes. Esta línea de investigación está siendo continuada y se están analizando nuevas sinergias (IL-12 con otras quimocinas) y viendo que el gen del interferón tiene una potente acción antitumoral.
El uso de vectores adenovirales portadores del cDNA de la interleucina humana IL-2 (AdIL2) o del heterodímero de cDNA de la IL-12 puede producir elevadas concentraciones de citoquinas localmente en las regiones circundantes a los tumores, lo cual ayuda a generar una respuesta inmune suficiente para inhibir el crecimiento del tumor. Esto se ha probado con metástasis derivadas de carcinoma de colon, mediante la administración intravenosa del vector, ya que esta ruta aporta >90% del vector hacia el parénquima hepático, resultando en niveles significativos de cada citoquina localmente, con niveles mínimos en el suero. Para examinar el efecto terapéutico, los vectores AdIL2 y AdIL12 fueron evaluados en un modelo de metástasis hepática que se estableció por la inyección de 3 × 104 células a la línea de carcinoma de colon C26, pobremente inmunogénica, en ratón. Los animales recibieron dosis de 108 upf intravenosamente durante dos días tras la implantación del tumor de los vectores AdIL2, AdIL12 y control. Se comparó el crecimiento tumoral en los tres tipos de animales, siendo de 116 ± 25 mm2 tras dos semanas en el caso de los control, 16 ± 8 mm2 en el caso de los tratados con AdIL12 y de 6 ± 6 mm2 (P < .01,ambos comparados con el control)en el caso de los tratados con AdIL2. El virus control demostró no tenes efecto antitumoral significativo, mientras que los portadores de interleucinas mostraron una ventaja se supervivencia significativa (P < .01), aunque sólo AdIL12 significó en una supervivencia real incrementada de 27 (control) a 37 días. Al hacer un ensayo de la citotoxicidad in vitro mediante radiación, AdIL12 mostró inducción de la actividad de las células NK.
USO DE VIRUS ADENO-ASOCIADOS RECOMBINANTES PARA ESTIMULAR INMUNIDAD ANTI-CÁNCER VÍA CITOQUINAS HUMANAS
IL-12 es una citoquina heterodimérica capaz de inducir regresión tumoral e inmunidad anti-tumoral prolongada. Los vectores basados en virus adeno-asociados recombinantes (rAAV) son ventajosos para la terapia génica por su carencia de patogenicidad en humanos, su capacidad de infectar células tanto en división activa como en estado de no división y por su amplio rango de infectividad. Es posible construir vectores rAAV que expresen una citoquina humana, por ejemlo la IL-12, con el fin de usarlos en estudios inmunoterapéuticos en modelos de ratón mediante la inserción de los cDNA’s de IL-12 (mIL-12) p53 y p40 en el plásmido pRep4 e insertando el sitio interno ribosomal del virus de la encefalitis entre los dos cDNA’s. El cassette de expresión del mIL-12 (que contiene el promotor vírico del sarcoma de Rous y una señal de poliadenilación del virus de simio 40) se subclona dentro del plásmido AAV (llamado p008Sub/NeoR porque contiene además dos secuencias terminales repetidas de AAV y el gen de resistencia a la neomicina conducido por el promotor de la timidina quinasa). Los viriones rAAV se generan (104 partículas infecciosas/ml) mediante cotransfección del rAAV-mIL-12 y un plásmido helper 8pAAV/Ad) dentro de 293 células que previamente han sido infectadas con un adenovirus tipo 5. Tras la infección de fibroblastos (D6) con rAAV-mIL-12, los clones G418 resistentes se aislan mediante ensayo enzimático. La producción biológica de IL-12 por el vector se comprueba por la existencia de producción de interferón-gamma, proliferación linfocitaria y por ensayos de citotoxicidad. Estos vectores basados en virus adeno-asociados pueden servir para modular los efectos de mIL-12 aisladamente o en combinación con otros agentes antitumorales.
PÉRDIDA DE TUMORGENICIDAD E INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO TUMORAL MEDIANTE LA TRANSFERENCIA ADENOVIRAL DEL GEN MHC DE CLASE I
Como es sabido, complejo MHC es de gran ayuda para la respuesta celular inmune y las células cancerígenas no son una excepción. Para ayudar al sistema inmune a luchar contra el cáncer es posible diseñar diversas estrategias, una de las cuales implica al MHC de clase I. Un estudio utilizó vectores adenovirales para incrementar la expresión de MCH de clase I alogénico y xenogénico en dos líneas celulares tumorales pobremente tumorgénicas de rata: MCA-26 (H-2Kd ) y LN-4. Para ello se introdujo el gen de ratón H-2Kb en ambas líneas y se observó que la expresión del antígeno xenogénico del MHC de clase I inhibió completamente la tumorgenicidad de la línea tumoral, mientras que la expresión del antígeno alogénico de MHC de clase I sólo pudo hacerlo parcialmente. Los vectores adenovirales recombinantes (AdV-H-2Kb ) mostraron ser altamente eficientes en la transducción tanto in vivo como in vitro . Las ratas LN4 con regresión tumoral mostraron una inmunidad contra apariciones posteriores del tumor parental
USO DE MOLÉCULAS COESTIMULADORAS DEL SISTEMA INMUNE VÍA VECTORES ADENOVIRALES
La transfección de la molécula coestimulatoria B7-1 (CD80) en células tumorales de ratón puede incrementar la inmunidad antitumor y erradicar el crecimiento tumoral. Para probar las respuestas de los linfocitos autólogos frente a células tumorales humanas infectadas por un adenovirus portador de la B7-1 (AdB7), se dividieron células procedientes de diversos tipos de cáncer (sarcomas, adenocarcinomas, melanomas y mielomas múltiples) en tres grupos:
La expresión de B7 fue verificada mediante citrometría de flujo, siendo estudiada la actividad citotóxica contra los tres grupos de células presentada por los linfocitos de sangre periférica de los pacientes. Se encontró una respuesta contra las células B7-1+ significativamente incrementada en relación a los otros dos grupos de células, sobretodo en presencia de interleucina-12 o a bajas dosis de interleucina-2. Las células tumorales B7-1+ fueron también eliminadas más eficientemente que las B7-1- en los ensayos de citotoxicidad mediada por células NK, siendo este resultado aún más significativo cuando los linfocitos habían sido pretratados con IL-12. Se encontró expresión de CD80 en las células NK humanas, un receptor de B7-1. Esta elevada eficiencia de la transferencia génica mediada por AdB7, así como la elevada respuesta de los linfocitos vía B7-1 sugieren que los vectores AdB7 pueden ser efectivos en la inmunoterapia del cáncer humano.
COMBINACIÓN DEL USO DE VECTORES ADENOVIRALES Y LAS TÉCNICAS CONVENCIONALES CONTRA EL CÁNCER
TRANSDUCCIÓN IN VIVO DE VECTORES ADENOVIRALES CON LIPOSOMAS POLICATIÓNICOS
Aunque la elevada eficiencia de transducción que los vectores adenovirales muestran in vitro ha sido bien documentada, no está claro si la transducción en tumores sólidos in vivo es igualmente eficiente. En los primeros experimentos la transducción de los vectores adenovirales se limitó a los lugares más cercanos al punto de inyección. Para mejorar la eficiencia de transducción in vivo, se han desarrollado experimentos que implican la utilización simultánea de vectores adenovirales con liposomas catiónicos en modelos animales. Un ejemplo de ello se basa en adenovirus portadores del gen humano de la fosfatasa alcalina placentaria (AdALP), mientras que en el liposoma el gen marcador se trataba del de la lipofectamina. Mediante la combinación de un AdALP portador del factor estimulador murínico de colonias granulocito-macrófago (AdmGM-CSF) y liposomas, la eficiencia de transducción se vió incrementada en más de un 15% en líneas tumorales del tipo CT26, respecto a la utilización de los vectores adenovirales solos.
En modelos animales, mediante la combinación del AdALP y los liposomas, la distribución del gen marcador a través de la masa tumoral se muestra más profunda y extensa. Todo ello sugiere que las limitaciones de transducción en tumores sólidos mostradas por los vectores adenovirales pueden ser superadas mediante el uso de liposomas catiónicos.
A pesar de que los vectores adenovirales demuestran ser muy efectivos como portadores de genes exógenos hacia el interior de las células de mamífero, se requieren frecuentemente dosis muy elevadas para producir una transferencia efectiva in vivo, lo que puede generar una citotoxicidad no deseada. Para mejorar la expresión del transgén introducido mediante adenovirus defectivos reduciendo a su vez las reacciones adversas, se ha probado la habilidad de complejos lipídicos policatiónicos para estimular la adsorción de los adenovirus. Tras la infección simultánea con vectores adenovirales, preparaciones de policationes, lípidos catiónicos y CaCl2, se ha observado un incremento en la expresión del transgén in vitro. Un vector adenoviral E1-defectivo fue mezclado con varios policationes y se evaluó la actividad de la beta-galactosidasa para determinar las concentraciones óptimas de policationes para aumentar la transferencia génica mediada por el vector viral, siendo estas de 5-10 microgramos/mililitro para polibreno, 400 microgramos/mililitro para sulfato de protamina, 10 microgramos/mililitro para DOTAP, 2,5 microgramos/mililitro para lipofectamina y 62,5 mM para CaCl2.
La presencia de policationes incrementó la presencia de actividad beta-galactosidasa en tres de seis líneas celulares establecidas. Resultados similares se obtuvieron usando cultivos celulares primarios de tumores y en dos leucemias primarias. Aunque no se obtuvieron resultados favorables mediante inyecciones intratumorales en modelos de melanomas en inmunodeficiencia combinada severa.
COMBINACIÓN DE RADIOTERAPIA Y TERAPIA GÉNICA CON VECTORES ADENOVIRALES
No hay que contemplar la terapia génica con vectores adenovirales como un único medio de acción contra el cáncer, sino más bien como el complemento ideal a las terapias ya existentes, dependiendo siempre de cada caso en particular. De este modo, los médicos pueden plantearse el diseño de estrategias sensibilizadoras a los tratamientos convencionales; este es el caso del uso de vectores adenovirales como una estrategia genética radiosensibilizadora para el tratamiento del cáncer de próstata. Las células provenientes de individuos con el desorden ataxia telangiectasia (AT) son hipersensibles a la radiación ionizante. Se pensó en la posibilidad de usar el producto génico de AT en las células tumorales para poder así incrementar la eficacia de la radioterapia. Por tanto, se procedió a infectar una línea celular tumoral mutante para p53 con un vector adenoviral expresando el RNA antisentido ATM de varios dominios del gen ATM (gen AT mutado). Los análisis inmunoblot de las células transfectadas revelaron expresión atenuada de la proteína ATM durante dos días tras la transfección. Comparadas con células infectadas por adenovirus portadores del gen de la beta-galactosidasa, las células con ATM mostraron un control aberrante del punto de control del ciclo celular que da paso hacia la fase S tras la exposición a radiación ionizante, por tanto, bajo esas condiciones la sensibilidad de las células a la radiación había sido estimulada. Por ello, la terapia antisentido con ATM podría representar una gran mejora en el tratamiento del cáncer por radioterapia.
Otra aplicación de los vectores adenovirales en este sentido se refleja en el uso de 5-bromo-2’-deoxicitidina (BrdC) simultáneo a adenovirus (ADV-TK) portadores del gen de la timidina quinasa del herpes simplex (TK) para tratar células de glioma de rata RT2 in vitro. Este tratamiento induce una significativa radiosensibilización de las células en comparación con las infectadas con adenovirus portadores del gen de la beta-galactosidasa. La muerte celular obtenida de este modo sigue una buena correlación a la incorporación del BrdU al DNA y a la apoptosis observada. Mientras la radiación sola (4 Gy) es relativamente inefectiva en la inducción apoptótica, la combinación de ambos tratamientos produce una respuesta sinérgica. Estos estudios se han realizado también in vivo haciendo crecer la línea tumoral RT2 en ratas. Se encontró que volúmenes relativamente elevados de virus inyectados (100-150 microlitros) a tasas de menores o iguales a un microlitro por minuto, resultaban en óptimos y uniformes resultados. Usando estas condiciones óptimas, se consiguió una infección del 40% de adenovirus en el tumor. Infecciones de los tumores RT2 con ADV-TK seguidas de administración continuada de BrdC resultaron en regresiones significativas (.001<P<.009) de los tumores seis días después de la radiación en comparación con los controles.
El gen p53 es también alternativa de utilización simultánea a la radiación, ya que su papel central en la regulación del ciclo celular lo convierte en un sinergizador muy apropiado para las terapias más convencionales contra el cáncer. Para esclarecer cuáles podrían ser sus funciones concretas en este campo, se han realizado diversos estudios, uno de los cuales implicaba el uso de células de glioma mutantes y no mutantes para p53, analizadas antes y después de la aplicación de radiación ionizante en el contexto de la terapia del p53. Tres tipos celulares fueron transducidos con un vector adenoviral portador del p53 humano y los genes de la ß-galactosidasa de Escherichia coli (AdLacZ, virus control) antes de la aplicación de radiación ionizante (0-20 Gy). Mediante Western inmunoblotting se estudiaron los cambios en los genes p53, p21 y Bax, mientras que las alteraciones del ciclo celular y la apoptosis se estudiaron mediante citrometría de flujo y nuclear staining. La supervivencia celular se estudió por ensayos de clonación. Durante 48 horas de exposición al Adp53, las tres líneas celulares mostraron expresión de p53 a una pfu de 100. El gen p21, un efector inducible por p53, se vio sobreexpresado y las células se pararon en fase G1. La expresión del gen Bax, quien juega un papel en la inducción apoptótica vía p53, no se vio afectada ni por el vector ni por la radiación. La supervivencia celular y la apoptosis variaron tras la terapia del p53: las células no mutadas mostraron variaciones mínimas ante los tratamientos, juntos y por separado; las células mutadas mostraron, en cambio, apoptosis masiva y muerte tras 48 horas de la aplicación del Adp53, independientemente de la radiación; otra línea celular, también mutada para p53, mostró únicamente apoptosis al combinar ambos tratamientos, con proporcionalidad directa con la radiación aplicada. La supervivencia de las tres líneas celulares se redujo dramáticamente tras >10 Gy. La transducción con AdLacZ no afectó al ciclo celular ni a la apoptosis. Por tanto, las respuestas a la terapia con p53 son variables según el tipo celular utilizado.
COMBINACIÓN DE QUIMIOTERAPIA Y TERAPIA GÉNICA CON VECTORES ADENOVIRALES
La respuesta de las células tumorales a los tratamientos más convencionales, como la quimioterapia, puede verse significativamente incrementada gracias a las estrategias diseñadas por la terapia génica. En el caso específico del uso de adenovirus como vectores, vuelve a aparecer el gen p53 como arma en la lucha contra el cáncer. Se puede diseñar un adenovirus portador de la versión funcional de este gen supresor de tumor (Ad-p53) para tratar células de cáncer de pulmón mutantes para este mismo gen y así conseguir una mejora en su respuesta a la droga cis-diamminodicloroplatino(II). Usando ensayos colorimétricos se puede examinar la citotoxicidad celular en cultivos infectados por este vector. De este modo, por ejemplo, el Ad-p53 muestra efectos sinérgicos con varios agentes que dañan el DNA para seis de siete líneas celulares estudiadas por un equipo de investigadores, mientras que el Ad-p53 muestra efectos aditivos con un agente antitubulina en cuatro de las líneas usadas. Los resultados fueron aportados por citrometría de flujo y análisis de fragmentación del DNA, revelando ambos métodos que dosis subletales de Ad-p53 incrementaban las respuestas apoptóticas inducidas por los agentes que dañan el DNA en seis de las siete líneas celulares.
INMUNOTERAPIA COMBINACIONAL DE VACUNAS ANTI-TUMORALES Y TRANSFERENCIA GÉNICA MEDI
Existen numerosos estudios actualmente que relacionan las vacunas contra el cáncer (que usan células tumorales modificadas genéticamente para expresar inmunogenes) y la terapia génica del cáncer usando transferencia génica mediada por adenovirus (AdV). Uno de estos estudios utilizó células tumorales de ratón (VKCK ) cotransfectadas con los genes codificadores para el factor de necrosis tumoral y la molécula coestimuladora B7 para estimular la inmunidad anti-tumor. La línea celular transfectada mostró una reducción de la tumorgenicidad y regresión tumoral. Su posterior inoculación indujo inmunidad protectora en los animales; los linfocitosT CD4+ y CD8+ se involucraron en la fase inductora, mientras que únicamente las células TCD8+ mediaron la fase efectora. Los ratones susceptibles a tumores VKCK desarrollaron una respuesta dominante mediada por células T helper tipo 2, mientras que los resistentes VKCK-TNF-alfa /B7-1 desarrollaron una respuesta dominante mediada por células T helper tipo 1 hacia VKCK , indicando que la regresión tumoral se relacionaba con un cambio en el perfil de citoquinas delk huésped desde el tipo 2 al tipo 1. La vacunación de las células VKCK-TNF-alfa /B7-1 inhibió la formación de tumores derivada de una dosis única de células VKCK (3 × 106 )y erradicó tumores de 3 días de vida, aunque no tumores de 10 días. La inyección intratumoral de adenovirus portadores de TNF-alfa inhibió significativamente el crecimiento tumoral, pero no consiguió erradicar tumores bien establecidos. Sin embargo, la terapia combinacional de la vacunación de las células VKCK-TNF-alfa/B7-1 y de la transferencia génica de TNF-alfa mediada por adenovirus consiguió inhibir significativamente el crecimiento tumoral y además erradicar tumores VKCK de 10 días de vida en tres de diez ratones.
El análisis de la expresión del receptor adenoviral del virus coxackie (CAR) y los receptores de integrina en la superficie del linfoma mediante citometría de flujo mostró que el el 88% de las células “Daudi”, el 69% de las células “Raji” y el 6% de las células “OCI-Ly8-LAM53”( tres tipos de células de linfoma) expresaban CAR en su superficie. De acuerdo con los datos, la infección adenoviral en las células de linfoma parece ser mediada por CAR. En cambio, los receptores de integrina no parecen jugar un papel importante, ya que los linfomas se mostraron negativos para ellas.
En conclusión, los estudios muestran que líneas celulares derivadas de células B pueden ser transfectadas eficientemente por vectores adenovirales, mostrando incluso una mayor eficiencia en presencia de liposomas catiónicos.
ADMINISTRACIÓN SISTÉMICA DE CORTICOESTEROIDES SIMULTÁNEA A LA TERAPIA GÉNICA MEDIADA POR VECTORES ADENOVIRALES
Una de las limitaciones primarias de la terapia génica mediada por vectores adenovirales es la generación de respuestas inflamatorias anti-Ad que pueden inducir toxicidad clínica y reducir la eficacia de la transferancia génica. Los efectos de la inmunosupresión en esas respuestas inflamatorias, la expresión del transgén y la toxicidad no han sido analizados sistemáticamente en el contexto humano de los tratamientos basados en vectores adenovirales. Un estudio investigó la administración sistémica de corticoesteroides para mitigar las respuestas inmunes anti-vector. En un estudio previo se demostró que un vector adenoviral portador del gen de la timidina quinasa del herpes simplex (HSVtk) administrado intrapleuralmente a pacientes con mesotelioma resultó en significativas, aunque relativamente superficiales, transferencia génica de HSVtk y producción de anticuerpos anti-Ab en las respuestas humoral y celular. Cuando un grupo similar de pacientes fue tratado simultáneamente con Ad.HSVtk y cortiecoesteroides, se demostró una reducción de la respuesta inflamatoria clínica, pero no se pudo demostrar una inhibición de la formación de anticuerpos anti-Ab o de la activación mononuclear de las células en sangre periférica. La administración de corticoesteroides no tuvo, asimismo, efecto sobre la presencia de transferencia génica intratumoral. Los resultados sugieren que la administración sistémica de corticoesteroides en el contexto de la terapia génica basada en adenovirus puede limitar la toxicidad clínica aguda, pero no inhibir las respuestas celular y humoral contra los vectores.