A.
Selección De La Fuente
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Proteínas con idénticas funciones se encuentran en diferentes organismos, por supuesto es considerable la variación en las propiedades de una proteína en particular de acuerdo a la fuente. varios criteris se deben seguir para la seleccionde la fuente, entre estas es facilidad para su obtencion y que la proteina autilizar en la fuente se pueda obtener en grandes cantidades. hoy debido alas tecinicas de clonamiento molecular se han generado nuevas tecnicas para obtener proteinas. |
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Métodos De Solubilización
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el primer paso para la solubilizacion de una proteina es su ubicacion en una solucion, sin embargo esta primero debe ser liberada de la celula. Para esto es necesario someter la celula a un proceso de lisis. Se puede utilizar lisis osmotica si la celula es de origen animal, si es bacteria o celula vegetal se utiliza enzima capaz de degradar la pared celular, ej:lisosima para las bacterias. tambien se utilizan metodos mecanicos para la irrupción de la celula, que pueden incluir arena o alunima, entre estos se cuenta el uso de juguera, homogenizadores, morteros, sonicacion, etc. todos estos procesos, son acompañados por un paso siguiente de centrifugacion o filtracion. |
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c.
Estabilización
| una vez que la proteina ha sido removida de su ambiente natural se ve expuesta a muchos agentes que pueden dañarla. estas influencias deben ser cuidadosamente controladas. las proteinas pueden ser afectadas por pH, temperatura, proteasas, oxidacion de puentes disulfuro, contaminacion por metales pesados, concentracion de sal, etc. Esta variables se pueden controlar con el uso de tampones, mantenciona baja temperatura, uso de inhibidores, etc. |
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d.
Ensayos
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Cuando una proteina es purificada es necesaria
detectar su presencia para indicar su pureza. Una proteina se encuntra en
muy pequeñas cantidades en cada celula por lo que para su deteccion se
hace necesario el uso de ensyos sensibles y especificos. estos ensayos
deben ser repetidos en cada paso de la purificacion. las proteinas pueden
ser monitoreadas de acuerdo a sus caracteristicas espectroscopicas oo de
fluorescencia, se pueden realizar ensayos enzimaticos cuando corresponda
(proteina a purificar= enzima).
Tambien, es posible utilizar anticuerpos para la deteccion de proteinas a traves del test de ELISA. En este un anticuerpo se encuentra unido a una matriz solida y es capaz de reconocer nuestra proteina. Luego un segundo anticuerpo se une al compljo formado por el anticuerpo 1, el anticuerpo2 se encuentra unido covalentemente a un enzima capaz de liberar un producto medible. |
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e.
Estrategia De Purificación
| La purificación de proteinas se realiza por procedimientos de fraccionamiento. Las propiedades fisicoquimicas de la proteina de interes seran utilizadas para separarla progresivamente de otras sustancias. La idea es miimizar la perdida de la proteina deseada, pero eliminar selectivamente los otros componenetes de la mezcla. |
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