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En 1903, el botanico ruso Mikhail Tswett describio la separacion de pigmentos de hojas en solucion, a traves del uso de adsorbentes solidos. El llamo a este proceso cromatografia(del griego: chroma=color y graphein=escribir), presumiblemente por la bandas de colores formadas en el adsorvente por los componenetes de los pigmentos separados. En la cromatografia, una mezcla de sustancias se disuelve en un liquido o fluido gaseoso conocido como fase movil. La solucion resultante es percolada a traves de una columna que contiene una matriz solida porosa conocida como fase estacionaria. La interaccion de los solutos con la fase estacionario retarda su progreso a traves de la matriz y varia de acuerdo a las propiedades de los solutos. Esto causa una diferencia de migracion la que produce la separacion de los componente de la mezcla. Los componentes pueden ser recolectados en fracciones para su analisis. |
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a.
Intercambio Iónico
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En este proceso de intercambio ionico, los iones, son unidos electrostaticamente a una matriz inerte y son reemplazados por iones en solucion. R+ A- + B- « R+B- + A- Aqui R+ A- es el intercambiador ionico en que las formas A- y B- representan los anioes en solucion. Existen cromatografias de intercambio cationico y de intercambio anionico y ambas son de tipo reversibles. Las proteinas son poliionicas y contiene grupos acido-base, por lo que su afinidad por los intercambiadores ionicos o columnas de intercambio ionico dependera fuertemente del pH de la solucion que se este eluyendo por la columna. Ademas hay que considerar la identidad de los iones y su concentracion que van a competir con la proteina por lo sitios de union. De esta forma la proteina se va a unir a la columna dependiendo el pH de la solucion y los inoes que esta cuente. lapurificacin comienza con el proceso de elucion, en el cual la concentracion de los iones salinos es aumentada progresivamente lo que permite la liberacion de las diferentes prteinas unidas a la columna en forma paulatina, liberandose primero aquellas que tenian menor afinidad por la columna y finalmente las de mayor afinidad.
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Cromatografía En Papel
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La cromatografia en papel, desarrollada en 1941 por Archer Martin y Richard Synge, ha jugado un rol indispensable en el analisis bioquimico debido a su habilidad para separar pequeñas moleculas como aminoacidos y oligopeptidos y su simple equipamiento. La mezcla con la muestra es aplicada a 2 cms sobre el final de la tira de papel filtro. Despues de secarse, el extremo es sumergido en una mezcla de solvente acuoso y organico, por ej: agua:butanol: acido acetico en una razon 4:5:1. El papel debe estar en contacto con vapores equilibrados del solvente, para esto se utiliza una camara sellada. Las razones de migracion de las substancias sera gobernada por la solubilidad relativa de en la fase polar estacionaria y la fase no moleculas polar movil. Las moleculas se separan de acuerdo a su polaridad, con apolares moviendose mas rapido que las polares. Los componentes que han migrado pueden ser revelados de diferentes formas ya sea, si son compuestos marcados radiactivamente para los cuales existen variados metodos de deteccion, o compuestos fluorescentes los que pueden ser observados la luz UV, o con el uso de reagentes que produzcan reacciones de coloracion. |
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c.
Filtración En Gel
| En la filtracion por gel, tambien llamada exclusion por tamaño, las moleculas son separadas de acuerdo a su peso y forma. En esta, la fase estacionaria esta formada gotas de una resina hidratada, material similara una esponja, que contiene poros que se extiende en un rango muy estrecho de dimensiones moleculares. la columna que contiene esta resina actuaria como un "colador molecular". La mayoria de los geles son hechos de agarosa dextran y poliacrilamida. Esta tecnica puede ser utilizada para dterminar peso molecular |
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d.
Cromatografía De Afinidad
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Esta se basa en la
capacidad de las proteinas para unirse a determinadas moleculas fuertemente
pero no covalentemente. En esta tecnica, una molecula llamada ligando, es
unida covalentemente a una matriz porosa e inerte.
Asi cuando una solucion impura es pasada a traves de este material, la proteina deseada se une al ligando inmovilizado, mientras el resto de las substancias pasan libremente a por la columna con el buffer. La proteina deseada puede ser recuperada, en forma altamente purificada, por el cambio de las condiciones de elucion, liberandola. Diferentes ligando pueden ser utilizados, como pueden ser sustratos de enzimas o mayoritariamente el uso de anticuerpos especificos para la proteina blanco. |
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e.
Otras Cromatografías
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Otros tipos comunes de
cromatografia utilizados son la de adsorpcion, donde las moleculas son
adsorbidas fisicamente en superficies insolubles (alumina, silicagel) y
eluidas por solventes polares puros o mezclados, esta permite la separacion
de moleculas no polares.
En la cromatografia de capa fina (TLC), la fase estacionario esta formada por una muy delgada capa de material solido sobre plastico o papel, es utilizda en forma similar a la cromatografia en papel. En la cromatografia liquida de alta resolucion (HPLC), el uso de largas y estrechas columnas llenadas con una fina matriz, permite una mejor resolucion y un acortamiento de los tiempos de retencion. Esto permite resolver separaciones que por otros metodos no ha sido posible, tiempos mas cortos, una alta sensibilidad lo que permite determinaciones cuantitativas y la capacidad de automatizacion. |
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